王 茜 ，鄧益琴，孫承文，林梓陽(yáng)，蘇雯曉，劉夢(mèng)瑤，程長(zhǎng)洪，郭志勛，馮 娟

1. 天津農(nóng)學(xué)院，天津 300392

2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380

維氏氣單胞菌 (Aeromonas veronii)，隸屬于氣單胞菌屬[1]，是一種革蘭氏陰性短桿菌[2]，普遍存在于水環(huán)境中[3-4]，可引起草魚 (Ctenopharyngodon idella)、羅非魚 (Tilapia mossambica) 等多種淡水魚類患病[5-6]，常表現(xiàn)出體表潰爛、腹腔充血和臟器不同程度出血等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致其死亡[7]；同時(shí)，維氏氣單胞菌引發(fā)的魚病具有傳染性強(qiáng)、死亡快的特點(diǎn)[8-9]，可造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。除了會(huì)危害多種魚類外，維氏氣單胞菌還可導(dǎo)致青蝦 (Macrobrachium nipponense) 和中華絨螯蟹 (Eriocheir sinensis) 等甲殼類動(dòng)物出現(xiàn)“軟殼病”[10]；造成林蛙 (Rana amurensis) 的“紅腿病”等；還會(huì)引起人類的腹瀉、胃腸炎、腦膜炎等[11-12]，是一種人、獸以及水生動(dòng)物共患的條件致病菌[13]。

維氏氣單胞菌具有多種與其致病性相關(guān)的因子[14-15]，如鞭毛蛋白、密度感應(yīng)系統(tǒng) (Quorum sensing, QS) 和Ⅲ型分泌系統(tǒng) (Type Ⅲ secretion system, T3SS) 等，在細(xì)菌的致病過(guò)程中起到重要作用[16]。T3SS是一個(gè)由內(nèi)外膜環(huán)、尖針和轉(zhuǎn)位子組成的納米注射器樣系統(tǒng)[17-18]，可以將毒性蛋白直接注射到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而負(fù)責(zé)毒力因子的轉(zhuǎn)運(yùn)[19]，是維氏氣單胞菌目前研究最多的分泌系統(tǒng)。Sha等[20]通過(guò)構(gòu)建缺失突變體，其毒性和致病性降低，證明了它作為毒力因子的作用。ascF基因調(diào)控的蛋白是T3SS系統(tǒng)的重要組成部分，與其致病性密切相關(guān)，溫度、鹽度及pH等不同環(huán)境因子會(huì)影響T3SS基因的表達(dá)，進(jìn)而影響其致病能力[21]。鞭毛蛋白是氣單胞菌重要的毒力因子之一，是TOLL樣受體5 (TLR5) 的重要配體，從而介導(dǎo)細(xì)菌的黏附和入侵[22]。Tian等[23]剖析了鞭毛結(jié)構(gòu)，表明鞭毛蛋白可以黏附在宿主表面形成生物膜，有助于效應(yīng)蛋白穿透宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)，揭示了鞭毛參與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)和致病機(jī)制等。fliE基因編碼形成的蛋白位于鞭毛蛋白的桿狀結(jié)構(gòu)，可以和FlgB蛋白相互作用，起到穩(wěn)定和激活作用[24-25]，對(duì)于鞭毛蛋白分泌、鞭毛裝配和TLR5誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)至關(guān)重要[26]。QS 是細(xì)菌細(xì)胞間常見(jiàn)的一種通訊機(jī)制[27]，能夠通過(guò)分泌一些小分子自誘導(dǎo)物 (Autoinducer, AI) 相互感知[28]，造成細(xì)菌致病性的改變[29]。luxR基因編碼的家族調(diào)控蛋白在細(xì)菌群體感應(yīng)信號(hào)系統(tǒng)中起到樞紐作用，可以參與到細(xì)菌發(fā)光、QS調(diào)控、致病性及生物膜形成等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中[30]。

對(duì)嗜水氣單胞菌 (A. hydrophila) 的研究表明，環(huán)境因子可能與細(xì)菌的致病機(jī)制相互作用，導(dǎo)致細(xì)菌毒力和抗性增加，其毒性的表達(dá)受溫度、pH及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等外界環(huán)境因子影響[31]。然而，目前關(guān)于不同環(huán)境條件對(duì)維氏氣單胞菌的重要致病因子表達(dá)及其致病性影響的研究較少。本文通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)2株維氏氣單胞菌ascF、fliE、luxR基因?qū)囟取H、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速、無(wú)機(jī)鹽離子等環(huán)境條件的響應(yīng)，探究環(huán)境因子對(duì)毒力因子致病機(jī)制的影響，為進(jìn)一步探究外界環(huán)境條件對(duì)維氏氣單胞菌致病性的影響，分析其致病機(jī)制，并建立維氏氣單胞菌病的預(yù)警模式提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

維氏氣單胞菌菌株分離自廣東省珠海市某花鱸養(yǎng)殖場(chǎng)，對(duì)分離到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，通過(guò)16S rDNA通用引物和gyrB基因引物進(jìn)行分子鑒定，進(jìn)一步對(duì)斑馬魚 (Danio rerio) 進(jìn)行攻毒感染實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)分子鑒定分析得到2株不同分子分型的強(qiáng)毒株18BJ181 (菌A)、18BW235 (菌B)，通過(guò)攻毒感染實(shí)驗(yàn)表明兩者對(duì)斑馬魚的毒力具有一定差異，故選為實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)所用的主要試劑有逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ，艾科瑞生物)，熒光定量反應(yīng)試劑盒 (SYBR Green ProTaqHS預(yù)混型qPCR試劑盒，艾科瑞生物)，Trizol (TRNzol Universal總RNA提取，天根科技公司)，RNAlater固定保存液 (賽默飛科技有限公司)，硫酸銅 (CuSO4)、硫酸亞鐵 (FeSO4)、硫酸鋅 (ZnSO4)、硫酸鎂(MgSO4) (廣州化學(xué)試劑公司)；胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptic Soy Broth, TSB) 培養(yǎng)基 (廣東環(huán)凱生物科技有限公司)。

1.3 菌株活化與培養(yǎng)

將實(shí)驗(yàn)室凍存的維氏氣單胞菌液于TSA培養(yǎng)基上劃線接種，28 ℃培養(yǎng)24 h，再挑取單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)過(guò)夜，測(cè)定菌液的OD600，同時(shí)用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌濃度。

1.4 菌株毒力因子對(duì)環(huán)境因素的響應(yīng)

1.4.1 對(duì)溫度的響應(yīng)

將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按5%的體積比分別接種于含有200 mL TSB培養(yǎng)基的統(tǒng)一規(guī)格的500 mL三角瓶中，分別在25、28和31 ℃下，180 r·min-1、不添加無(wú)機(jī)鹽離子的條件下培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)平行。培養(yǎng)14 h后取2 mL菌液，8 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入2 mL RNAlater固定液，-80 ℃保存。

1.4.2 對(duì) pH 的響應(yīng)

將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按5%的體積比分別接種于pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的含有200 mL TSB培養(yǎng)基的統(tǒng)一規(guī)格的500 mL三角瓶中，每個(gè)pH設(shè)置3組平行。28 ℃、180 r·min-1、不添加無(wú)機(jī)鹽離子的條件下培養(yǎng)14 h。然后取2 mL菌液，8 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入2 mL RNAlater固定液，-80 ℃保存。

1.4.3 對(duì)無(wú)機(jī)鹽離子的響應(yīng)

將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按5%的體積比分別接種于添加5 g·L-1的無(wú)機(jī)鹽離子 [亞鐵離子 (Fe2+)、銅離子 (Cu2+)、鎂離子 (Mg2+)、鋅離子 (Zn2+)] 的含有200 mL TSB培養(yǎng)基的統(tǒng)一規(guī)格的500 mL三角瓶中，28 ℃、180 r·min-1的條件下培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)平行。培養(yǎng)14 h后取2 mL菌液，8 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入2 mL RNAlater固定液，-80 ℃保存。

1.4.4 對(duì)培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的響應(yīng)

將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按5%的體積比分別接種于含有200 mL TSB培養(yǎng)基的統(tǒng)一規(guī)格的500 mL三角瓶中，分別在不同轉(zhuǎn)速150、180、210、240 r·min-1下，28 ℃、不添加無(wú)機(jī)鹽離子下培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)平行。培養(yǎng)14 h后取2 mL菌液，8 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入2 mL RNAlater固定液，-80 ℃保存。

1.5 RNA的提取及cDNA合成

將上述樣品取出后，按照Trizol法提取菌液的RNA。依照Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ說(shuō)明書合成cDNA，作為熒光定量PCR模板。

1.6 熒光定量PCR

根據(jù)各毒力因子的DNA序列設(shè)計(jì)qPCR特異性引物 (表1)，內(nèi)參基因?yàn)?6S rDNA。根據(jù)SYBR Green ProTaqHS預(yù)混型qPCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7 數(shù)據(jù)分析

以16S rDNA為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算各毒力因子的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果用Excel 2016軟件做柱狀圖，同時(shí)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 毒力因子對(duì)溫度的響應(yīng)

溫度是影響維氏氣單胞菌生長(zhǎng)的重要因素，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的25～31 ℃對(duì)維氏氣單胞菌的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，培養(yǎng)14 h后其菌量均可達(dá)到 (2～3) ×109CFU·mL-1。由于在適宜的溫度范圍內(nèi)，菌A的asc-F和fliE基因總體沒(méi)有較大差異 (圖1)，fliE基因?qū)囟瘸尸F(xiàn)“凸”型響應(yīng)模式，在28 ℃時(shí)響應(yīng)最高，而在25和31 ℃下表達(dá)量較低；luxR基因?qū)囟鹊捻憫?yīng)較為明顯，在28 ℃時(shí)表現(xiàn)出較高的表達(dá)量。菌B的ascF和fliE基因?qū)^低溫度 (25 ℃)響應(yīng)比較明顯，表達(dá)量顯著高于28和31 ℃；fliE基因?qū)囟鹊淖兓尸F(xiàn)“凹”型模式。這與菌A的表達(dá)模式不同，而luxR對(duì)溫度的響應(yīng)則同菌A一致。

圖1 維氏氣單胞菌ascF、fliE、luxR毒力基因?qū)囟鹊捻憫?yīng)注：*. 與對(duì)照組相比，具有顯著差異 (P＜0.05)；**. 與對(duì)照組相比，具有極顯著差異 (P＜0.01)。后圖同此。Fig. 1 Responses of virulence factors (ascF, fliE, luxR) of A. veronii to temperatureNote: *. Significant difference compared with the control group (P＜0.05); **. Very significant difference compared with the control group (P＜0.01). The same case in the following figures.

2.2 毒力因子對(duì)pH的響應(yīng)

2株菌的ascF、fliE和luxR基因?qū)H的響應(yīng)見(jiàn)圖2。ascF、fliE和luxR基因在pH為6.5偏酸性條件時(shí)的表達(dá)量較高，當(dāng)pH升高至8.0偏堿性條件時(shí)，表達(dá)量有所降低，同細(xì)菌生長(zhǎng)的最適pH介于7.0～7.5并不一致，說(shuō)明在較高的菌濃度中，毒力因子對(duì)pH的響應(yīng)同細(xì)菌本身的生長(zhǎng)無(wú)關(guān)。有意思的是，2株菌的ascF基因的表達(dá)模式相同，而fliE和luxR基因的響應(yīng)模式有較大差異，其中菌B對(duì)pH響應(yīng)較強(qiáng)，而菌A響應(yīng)較弱。

圖2 維氏氣單胞菌ascF、fliE、luxR毒力基因?qū)H的響應(yīng)Fig. 2 Response of virulence factors (ascF, fliE, luxR) of A. veronii to pH

2.3 毒力因子對(duì)無(wú)機(jī)鹽離子的響應(yīng)

圖3為2株菌的ascF、fliE和luxR基因?qū)o(wú)機(jī)鹽離子種類的響應(yīng)。與不添加無(wú)機(jī)鹽離子的對(duì)照組相比，分別添加 5 g·L-1Fe2+、Cu2+、Zn2+和 Mg2+的實(shí)驗(yàn)組對(duì)維氏氣單胞菌的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，培養(yǎng)14 h后其菌量?jī)H有108CFU·mL-1。ascF、fliE和luxR基因在添加Zn2+和Mg2+時(shí)的表達(dá)量較高，對(duì)于Fe2+則呈現(xiàn)負(fù)響應(yīng)模式；菌A和菌B對(duì)Zn2+的響應(yīng)模式不同，菌A響應(yīng)較強(qiáng)，菌B則較弱；與Zn2+不同的是，2株菌的ascF、fliE和luxR基因?qū)u2+響應(yīng)模式的差異在于菌B有較強(qiáng)的響應(yīng)，而菌A響應(yīng)較弱。

圖3 維氏氣單胞菌ascF、fliE、luxR毒力基因?qū)o(wú)機(jī)鹽離子的響應(yīng)Fig. 3 Response of virulence factors (ascF, fliE, luxR) of A. veronii to ions

2.4 毒力因子對(duì)轉(zhuǎn)速的響應(yīng)

轉(zhuǎn)速主要與培養(yǎng)基中的溶解氧相關(guān)，同時(shí)也代表一定情況下細(xì)菌接觸和利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同生長(zhǎng)情況。2株菌的生長(zhǎng)對(duì)轉(zhuǎn)速的響應(yīng)表現(xiàn)不太一致，菌A在低轉(zhuǎn)速情況下其生物量顯著低于高轉(zhuǎn)速，而菌B對(duì)轉(zhuǎn)速的響應(yīng)則無(wú)顯著差異。同時(shí)，2株菌的3個(gè)基因在對(duì)培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的響應(yīng)上表現(xiàn)出很大差異 (圖4)。整體而言，ascF基因的表達(dá)量普遍偏低，其差異并不顯著；菌A的fliE基因的表達(dá)量較低，而菌B則表現(xiàn)出對(duì)于高轉(zhuǎn)速的負(fù)響應(yīng)；luxR基因?qū)τ谵D(zhuǎn)速有最優(yōu)響應(yīng)范圍，菌A為210 r·min-1，菌 B為 150 r·min-1。

圖4 維氏氣單胞菌ascF、fliE、luxR毒力基因?qū)D(zhuǎn)速的響應(yīng)Fig. 4 Response of virulence factors (ascF, fliE, luxR) of A. veronii to rotating speed

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以2株維氏氣單胞菌的ascF、fliE和luxR致病因子為研究對(duì)象，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平上研究了3個(gè)基因?qū)囟?、pH、轉(zhuǎn)速和無(wú)機(jī)鹽離子等環(huán)境因子的響應(yīng)，并探究了維氏氣單胞菌的致病性和環(huán)境條件間的關(guān)系。結(jié)果顯示：維氏氣單胞菌的ascF、fliE和luxR毒力因子的表達(dá)受環(huán)境因子調(diào)控，在偏酸性 (pH 6.5～7.0)、中低轉(zhuǎn)速 (150～210 r·min-1) 及 Zn2+、Mg2+環(huán)境下，3種基因?qū)Νh(huán)境條件的變化為正響應(yīng)模式，相對(duì)表達(dá)量上調(diào)；而在偏堿性 (7.5～8.0)、高轉(zhuǎn)速 (240 r·min-1) 和 Fe2+、Cu2+環(huán)境下，3種基因的表達(dá)受抑制，呈現(xiàn)負(fù)響應(yīng)模式。

外界環(huán)境的pH變化可能會(huì)影響細(xì)菌生物膜的功能，如T3SS的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能，進(jìn)而對(duì)毒力基因表達(dá)量產(chǎn)生影響[32]。2株維氏氣單胞菌的ascF和fliE毒力基因在pH為8.0偏堿性條件下的表達(dá)量比pH為6.5和7.0的要低，表明其對(duì)低pH為正響應(yīng)，即在偏酸環(huán)境中，菌株更具有侵襲性，其致病性更強(qiáng)。在對(duì)嗜水氣單胞菌的毒力基因表達(dá)研究中也發(fā)現(xiàn)，菌株的4種毒力基因在中性或偏酸性條件下均得以表達(dá)，在堿性條件下只有1種毒力因子得以表達(dá)[33]，這與本文結(jié)果相似；Roy等[32]通過(guò)研究在不同溫度和pH下沙門氏菌 (Salmonella) 生物膜的形成表明，偏堿性環(huán)境下 (pH 7.0～8.0) 其生物膜更容易形成，且毒力基因的表達(dá)也有明顯提高，此結(jié)論與本文研究結(jié)果恰恰相反，表明不同菌種的致病機(jī)制可能有所差異。

環(huán)境溫度影響是細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖及毒力因子表達(dá)最重要的因素之一，其變化會(huì)影響細(xì)菌體內(nèi)多種重要蛋白的分泌及轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致細(xì)菌毒力因子表達(dá)的變化。本實(shí)驗(yàn)中，2株菌的3個(gè)基因?qū)囟鹊捻憫?yīng)有明顯差異，luxR基因在28 ℃時(shí)表達(dá)量較高，菌A的ascF基因在31 ℃表達(dá)量最高，fliE毒力基因在28 ℃時(shí)表達(dá)量最高；而菌B的ascF和fliE毒力因子在25 ℃時(shí)表達(dá)量最高，菌B對(duì)溫度變化的響應(yīng)偏低。也有研究表明，溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus) T3SSvscO基因的表達(dá)對(duì)溫度存在顯著的響應(yīng)[34]，銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) T3SS基因的表達(dá)受環(huán)境因子調(diào)控，環(huán)境因子通過(guò)影響cAMP (環(huán)磷酸腺苷) 在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平從而調(diào)節(jié)其功能[35]。本實(shí)驗(yàn)的維氏氣單胞菌ascF基因的表達(dá)則呈現(xiàn)典型的個(gè)體差異，說(shuō)明了T3SS對(duì)溫度響應(yīng)的多樣性。

本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)至240 r·min-1時(shí)，培養(yǎng)基中的溶解氧增高，細(xì)菌接觸培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表面積增加，致使細(xì)菌擴(kuò)增速度增加，細(xì)菌生物量增多，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌間密度增大，這可能降低了LuxR蛋白的C端與目的基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域的特異性結(jié)合及轉(zhuǎn)錄功能，促進(jìn)了QS的抑制作用，進(jìn)而導(dǎo)致維氏氣單胞菌的luxR基因表達(dá)量降低。對(duì)海參中的一種腐敗菌蜂房哈夫尼菌 (Hafnia alvei)的研究表明，當(dāng)改變外界環(huán)境因素時(shí)，其分泌的AI含量及活性均有不同程度的改變，證實(shí)了QS具有密度依賴性，與環(huán)境條件改變相關(guān)并呈現(xiàn)規(guī)律性變化[36]。本實(shí)驗(yàn)中，在pH為8.0的偏堿性及31 ℃環(huán)境下，維氏氣單胞菌的luxR毒力基因的表達(dá)量均比pH為7.5和28 ℃時(shí)的表達(dá)量低，表明在偏堿性及31 ℃的環(huán)境下，維氏氣單胞菌的QS可能受到了影響，導(dǎo)致其生物膜形成、毒力的轉(zhuǎn)運(yùn)及表達(dá)功能受到抑制，從而使luxR基因的表達(dá)量下降[37]。

本研究通過(guò)探究維氏氣單胞菌的ascF、fliE和luxR 3種致病因子在不同環(huán)境條件下基因表達(dá)量的變化表明，3種致病因子的表達(dá)受環(huán)境因素的調(diào)控，并呈現(xiàn)規(guī)律性變化，當(dāng)外界環(huán)境改變時(shí)，細(xì)菌可通過(guò)自身系統(tǒng)的改變調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而避免不利環(huán)境的影響。通過(guò)探究致病因子對(duì)不同環(huán)境條件的響應(yīng)，可為進(jìn)一步探究外界環(huán)境對(duì)維氏氣單胞菌致病性的影響，分析其發(fā)病機(jī)制提供一定的理論依據(jù)，為建立維氏氣單胞菌病的預(yù)警模式開(kāi)拓新的思路。