陳 旭 ，趙 旺 ，陳明強(qiáng) ，譚春明 ，于 剛

1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心/三亞熱帶水產(chǎn)研究院，海南 三亞 572018

2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

3. 海南省深遠(yuǎn)海漁業(yè)資源高效利用與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 三亞 527018

紅嬌鳳凰螺 (Strombus luhuanus) 又名籬鳳螺、紅口螺，隸屬于軟體動(dòng)物門、腹足綱、中腹足目、鳳螺總科、鳳螺科。分布于熱帶和亞熱帶海區(qū)，常棲息于潮間帶至水深36 m處的巖礫底或砂底。紅嬌鳳凰螺是植食性軟體動(dòng)物，以各種藻類和有機(jī)碎屑為食。其肉可食，貝殼形狀奇特，殼色鮮艷有光澤，可供觀賞，也可制作裝飾品，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高[1]。近年來，由于過度捕撈和環(huán)境污染加重，紅嬌鳳凰螺生存的近海水質(zhì)和生態(tài)環(huán)境不斷惡化，其漁獲量急劇降低，價(jià)格逐年攀升[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年約20 g的紅嬌鳳凰螺市場(chǎng)價(jià)格高達(dá)60元·kg–1，養(yǎng)殖利潤(rùn)十分可觀。

在沿海地區(qū)，由于潮汐、降水、高溫干旱或人類活動(dòng)等諸多因素的影響，海水鹽度經(jīng)常會(huì)發(fā)生不同程度的波動(dòng)。這種變化會(huì)在一定程度上影響貝類的呼吸代謝和酶活性[3]，最終導(dǎo)致其生長(zhǎng)緩慢、死亡率升高[4-5]。呼吸和排泄是貝類重要的生理活動(dòng)，耗氧率、排氨率是反映貝類呼吸代謝水平的重要指標(biāo)，其變化情況反映了鹽度對(duì)貝類正常生命活動(dòng)的影響程度[6-7]。在正常的生理?xiàng)l件下，貝類體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶類，可以幫助清除體內(nèi)的活性氧自由基(ROS)，增強(qiáng)貝類的抗氧化和免疫能力，保護(hù)機(jī)體免受氧化脅迫的損傷。同時(shí)，溶菌酶 (LZM) 是貝類非特異性免疫系統(tǒng)中重要的免疫酶之一，這些酶的活性是貝類生理和免疫狀況的重要指標(biāo)[8-9]。近年來，已經(jīng)在方斑東風(fēng)螺 (Babylonia areolata)[10]、縊蟶 (Sinonovacula constricta)[11]、菲律賓蛤仔 (Ruditapes philippinarum)[12]、大竹蟶 (Solen grandis)[13]、近江牡蠣 (Crassostrea ariakensis) 和長(zhǎng)牡蠣 (C. gigas)[14]等多種貝類中開展了鹽度對(duì)貝類的影響研究，這些研究證實(shí)了鹽度變化會(huì)對(duì)海洋貝類耗氧率、排氨率或免疫相關(guān)酶活性產(chǎn)生顯著影響。然而，有關(guān)鹽度脅迫對(duì)紅嬌鳳凰螺耗氧率、排氨率以及免疫相關(guān)酶活性的影響尚未見報(bào)道。因此，本研究采用不同鹽度處理，以紅嬌鳳凰螺耗氧率、排氨率、肝胰臟和肌肉CAT、總超氧化物歧化酶 (T-SOD)、過氧化物酶 (POD) 以及LZM活性的變化為參考指標(biāo)，探索鹽度脅迫對(duì)紅嬌鳳凰螺耗氧率、排氨率以及免疫相關(guān)酶活性的影響，以期探明紅嬌鳳凰螺的耐鹽性機(jī)制，為完善其人工養(yǎng)殖技術(shù)、活體運(yùn)輸和抗鹽新品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用紅嬌鳳凰螺來自海南三亞西島海域 (水深22～26 m、水溫28.5 ℃、鹽度31)，在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心 (海南陵水) 基地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前，紅嬌鳳凰螺暫養(yǎng)7 d，養(yǎng)殖密度100～150 個(gè)·m–2，期間投喂?jié)G苔 (Ulva lactuca)，實(shí)驗(yàn)前 24 h 停止投喂，選擇規(guī)格相近、活力好、體表無破損的個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)用紅嬌鳳凰螺平均體質(zhì)量為 (28.08±1.30) g。

CAT、T-SOD、POD和LZM試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。實(shí)驗(yàn)淡水為經(jīng)過曝氣24 h后的自來水，水質(zhì)指標(biāo)如下：水溫 28.1 ℃、pH 7.15、氨氮 0 mg·L–1、亞硝酸鹽0 mg·L–1。海水為經(jīng)過沙濾后的自然海水，水質(zhì)指標(biāo)如下：鹽度 32、pH 7.92、氨氮＜0.01 mg·L–1、亞硝酸鹽＜0.02 mg·L–1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耗氧率、排氨率實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[14]的設(shè)計(jì)，紅嬌鳳凰螺放入自然海水 (鹽度為32) 中，每天升高或降低1～2個(gè)鹽度，實(shí)驗(yàn)用水分別用海水與淡水或海鹽進(jìn)行配制。達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)定鹽度后再馴化7 d，開始實(shí)驗(yàn)。設(shè)置鹽度17、22、27、32和37共5組，其中32為對(duì)照組。每組設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放螺1個(gè)，3個(gè)空白呼吸瓶 (不放螺) 作為對(duì)照，在1 000 mL三角錐形瓶中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)采用靜水法，水浴控溫 (28±0.5) ℃，用保鮮膜和皮筋封口，持續(xù)時(shí)長(zhǎng)為6 h。

1.2.2 鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，把暫養(yǎng)在自然海水中7 d后的紅嬌鳳凰螺移入室內(nèi)塑料桶 (250 L) 內(nèi)進(jìn)行脅迫實(shí)驗(yàn)，每桶水體積約為100 L。實(shí)驗(yàn)同樣設(shè)置與上述相同鹽度梯度組，每組設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放螺30個(gè)。實(shí)驗(yàn)持續(xù)24 h，期間不間斷充氣。

1.3 樣品采集、分析和計(jì)算

采集紅嬌鳳凰螺的肝胰臟和肌肉立刻于–80 ℃凍存?zhèn)溆谩悠贩治銮坝? ℃冰箱中解凍，用DREAMEL研磨儀研磨，后放入EXPERT 18K-R冷凍離心機(jī)，4 ℃、2 500 r·min–1離心 10 min，取上清液用于 CAT、T-SOD、POD及LZM活性的測(cè)定。測(cè)定操作詳見南京建成生物工程研究所研發(fā)的試劑盒使用說明書，在多功能酶標(biāo)儀 (美國(guó)伯騰Biotek Synergy H1) 中測(cè)定吸光值，換算成相應(yīng)濃度或酶活值。

虹吸法采集水樣，根據(jù)GB 17378.4—2007《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第4部分 ：海水分析》，分別采用Winkler 碘量法和次溴酸鈉氧化法測(cè)定水中的溶解氧 (DO) 和氨氮 (NH3-N) 質(zhì)量濃度。耗氧率和排氨率通過下式計(jì)算：

式中：OCR、AER 分別為單位體質(zhì)量的耗氧率［mg·(g·h)–1］和排氨率［mg·(g·h)–1］；D0、D1分別為實(shí)驗(yàn)初始和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的DO質(zhì)量濃度 (mg·L–1)；N0、N1分別為實(shí)驗(yàn)初始和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后NH3-N質(zhì)量濃度 (mg·L–1)；V為呼吸瓶體積 (L)；W為紅嬌鳳凰螺軟體部干質(zhì)量 (g)；t為實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間 (h)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 紅嬌鳳凰螺耗氧率、排氨率

紅嬌鳳凰螺耗氧率和排氨率隨著脅迫鹽度的升高均呈先升后降的變化趨勢(shì) (圖1)，對(duì)照組耗氧率和排氨率均為最高，且顯著高于其他各實(shí)驗(yàn)組 (P＜0.05)。各組組間耗氧率差異均顯著 (P＜0.05)，其中，鹽度37組顯著高于17、22和27組 (P＜0.05)；鹽度27組顯著高于22和17組 (P＜0.05)；鹽度22組顯著高于17組 (P＜0.05，圖1-a)。鹽度37組排氨率顯著高于17、22和27組 (P＜0.05)；鹽度27組顯著高于22和17組 (P＜0.05)；鹽度22和17組組間差異不顯著 (P＞0.05，圖 1-b)。

圖1 鹽度脅迫對(duì)紅嬌鳳凰螺耗氧率、排氨率的影響注：不同字母表示各組間存在顯著差異 (P＜0.05)，下同。Fig. 1 Effect of salinity stress on oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of S. luhuanusNote: Different letters indicate significant difference among groups (P＜0.05). The same below.

2.2 肝胰臟CAT、T-SOD、POD和LZM的活性

隨著脅迫鹽度的增加紅嬌鳳凰螺肝胰臟CAT活性總體呈降低-升高-降低-升高的不規(guī)則變化 (圖2)。其中，對(duì)照組CAT活性最低，與鹽度22組差異不顯著，但均顯著低于其他各鹽度組 (P＜0.05，圖2-a)。紅嬌鳳凰螺肝胰臟T-SOD活性無顯著差異 (P＞0.05，圖2-b)。鹽度脅迫下，對(duì)照組、鹽度27和37組組間POD活性差異不顯著，但均顯著高于鹽度17和22組 (P＜0.05)；鹽度17與22組差異不顯著 (圖2-c)。隨著鹽度的增加肝胰臟LZM活性呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)。其中，對(duì)照組LZM活性最高，顯著高于各實(shí)驗(yàn)組 (P＜0.05)，但各實(shí)驗(yàn)組組間差異均不顯著 (圖2-d)。

圖2 鹽度脅迫對(duì)紅嬌鳳凰螺肝胰臟免疫酶活性的影響Fig. 2 Effect of salinity stress on immunoenzyme activities of hepatopancreas of S. luhuanus

2.3 肌肉CAT、T-SOD、POD和LZM的活性

隨著脅迫鹽度的增加紅嬌鳳凰螺肌肉CAT活性呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì) (圖3)。其中，鹽度22組CAT活性最高，顯著高于鹽度37組 (P＜0.05)，但與其他各組差異均不顯著；其他各組組間差異均不顯著 (P＞0.05，圖3-a)。紅嬌鳳凰螺肌肉T-SOD活性在實(shí)驗(yàn)過程中無顯著差異 (P＞0.05，圖3-b)。鹽度脅迫下，各實(shí)驗(yàn)組組間POD活性差異不顯著，均顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05，圖3-c)；對(duì)照組LZM活性最高，顯著高于各實(shí)驗(yàn)組 (P＜0.05)，鹽度22、27和37組組間差異不顯著，均顯著高于鹽度17組 (P＜0.05，圖3-d)。

圖3 鹽度脅迫對(duì)紅嬌鳳凰螺肌肉免疫酶活性的影響Fig. 3 Effect of salinity stress on muscle immunoenzyme activities of S. luhuanus

3 討論

3.1 鹽度脅迫對(duì)紅嬌鳳凰螺耗氧率、排氨率的影響

鹽度是海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要的生態(tài)因子，影響著貝類的分布和其生理代謝[15-16]。耗氧率和排氨率是水生生物有氧代謝的重要指標(biāo)，研究貝類的耗氧率和排氨率有助于了解其新陳代謝活動(dòng)的規(guī)律和變化特點(diǎn)，也能夠反映鹽度環(huán)境條件對(duì)其生理活動(dòng)的影響，是水生動(dòng)物生理學(xué)研究的重要內(nèi)容之一[7,13,17-18]。本研究結(jié)果表明，鹽度變化對(duì)紅嬌鳳凰螺耗氧率和排氨率均有顯著影響。鹽度在17～32時(shí)，耗氧率和排氨率隨著鹽度的升高而增大；鹽度為32時(shí)均達(dá)到最高值；當(dāng)鹽度大于32時(shí)，耗氧率和排氨率均隨鹽度的升高而下降。這一研究結(jié)果與泥螺 (Bullacta exarata)[19]、香螺 (Naptunea cumingii)[20]幼螺、巖扇貝 (Crassadoma gigantea)[21]幼貝的結(jié)果相似，即貝類的耗氧率和排氨率隨著鹽度的升高而上升，在某鹽度范圍內(nèi)達(dá)到最大值后，隨鹽度的升高而降低。這說明在超出紅嬌鳳凰螺適應(yīng)的海水鹽度范圍后，其為了適應(yīng)高、低鹽度的水環(huán)境而調(diào)整生理代謝活動(dòng)，例如通過主動(dòng)關(guān)閉進(jìn)、出水管或腹足收縮到貝殼內(nèi)，將機(jī)體與外部環(huán)境隔離，從而降低耗氧率和排氨率來適應(yīng)周圍環(huán)境滲透壓的變化[14,20]。研究發(fā)現(xiàn)，泥蚶(Tegillarca granosa)耗氧率和排氨率隨著鹽度的升高先降低后升高，但各實(shí)驗(yàn)組間差異并不顯著[22]；鹽度對(duì)僧帽牡蠣(Saccostrea cucullata)排氨率的影響不顯著[17]；九孔鮑 (Haliotis diversicolor supertexta)在鹽度21～36范圍內(nèi)耗氧率呈持續(xù)升高趨勢(shì)，排氨率在實(shí)驗(yàn)鹽度范圍內(nèi)也呈持續(xù)升高趨勢(shì)[23]。另有研究表明，鹽度急性應(yīng)激后，高鹽區(qū)縊蟶的耗氧率和排氨率高于低鹽區(qū)[24]。這些結(jié)果可能與物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近對(duì)鹽度適應(yīng)范圍不同以及貝類自身的生理特性相關(guān)[25]。

3.2 鹽度脅迫對(duì)紅嬌鳳凰螺肝胰臟和肌肉免疫相關(guān)酶活性的影響

貝類體內(nèi)不存在特異性免疫細(xì)胞和相應(yīng)的抗體，主要通過有異于脊椎動(dòng)物的獨(dú)特免疫機(jī)制來抵抗外界病原體的侵入同時(shí)進(jìn)行異己物質(zhì)的識(shí)別[26-27]。在逆境下，生物體內(nèi)ROS的過量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、DNA 損傷、生物膜損傷甚至破壞組織的完整性。正常條件下，貝類體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中的抗氧化酶類，可以清除體內(nèi)的ROS，增強(qiáng)貝類的抗氧化和免疫能力，保護(hù)機(jī)體免受氧化脅迫的損傷[6,9,28]。本研究中，鹽度脅迫對(duì)紅嬌鳳凰螺肝胰臟和肌肉T-SOD活性的影響在實(shí)驗(yàn)過程中無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明紅嬌鳳凰螺肝胰臟和肌肉內(nèi)正常產(chǎn)生的SOD可完全將鹽度脅迫產(chǎn)生的ROS分解成過氧化氫 (H2O2)，從而維持機(jī)體內(nèi)ROS“穩(wěn)態(tài)性動(dòng)態(tài)平衡”[29-30]。鹽度脅迫下，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組肝胰臟CAT活性均有不同程度的升高，而肌肉各實(shí)驗(yàn)組CAT活性與對(duì)照組差異均不顯著。說明機(jī)體受到鹽度脅迫產(chǎn)生了大量的ROS，通過氧化還原反應(yīng)進(jìn)行多層次應(yīng)激性調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致肝胰臟CAT活性升高以清除過量的ROS。應(yīng)激誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了大量的ROS，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，脂質(zhì)的過氧化物也隨之增多。機(jī)體抗氧化防御體系反應(yīng)，導(dǎo)致POD活性升高以對(duì)抗氧化應(yīng)激。而低鹽 (17和22) 脅迫下，肝胰臟POD活性降低的原因可能是機(jī)體清除脅迫所產(chǎn)生的過多ROS消耗了大量的POD或ROS超過抗氧化體系處理的閾值，機(jī)體組織受到了嚴(yán)重?fù)p傷，造成POD活性降低。同時(shí)，不論是高鹽還是低鹽脅迫，肝胰臟和肌肉對(duì)照組LZM活性均顯著降低，這勢(shì)必會(huì)降低紅嬌鳳凰螺殺滅和消化細(xì)菌的能力，在這種情況下紅嬌鳳凰螺很容易受到環(huán)境中的致病菌侵襲而死亡。研究發(fā)現(xiàn)，脅迫24 h后，方斑東風(fēng)螺體內(nèi)CAT活性隨著鹽度的升高顯著上升，T-SOD活性呈“抑制-誘導(dǎo)-抑制”的變化趨勢(shì)[10]；近江牡蠣血淋巴隨著鹽度的升高SOD活性呈“抑制-誘導(dǎo)-抑制”的變化趨勢(shì)，CAT活性先升高后降低，LZM活性隨著鹽度的升高先上升后降低[31]。巖牡蠣(C. nippona) 鰓組織SOD活性在鹽度24內(nèi)隨著鹽度的升高而升高，然后隨著鹽度的升高出現(xiàn)“降低-升高-降低-升高”的不規(guī)則變化；CAT活性在16～24范圍內(nèi)隨著鹽度的升高而升高，在32～40范圍內(nèi)隨著鹽度的升高而降低；LZM活性則出現(xiàn)“鋸形”不規(guī)則變化[32]。這些研究表明，高鹽或低鹽脅迫24 h后，貝類不同組織免疫相關(guān)酶活性均有所變化，但與鹽度變化不呈線性關(guān)系，而且在不同物種中未表現(xiàn)出相似的規(guī)律性，這可能是不同貝類生理特性不同以及對(duì)環(huán)境脅迫的耐受力有所差異所致。因此，開展對(duì)紅嬌鳳凰螺耗氧率、排氨率以及免疫相關(guān)酶活性的研究不僅有利于提高其自身的抗病能力和為培育耐鹽新品系提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)對(duì)其他貝類免疫機(jī)制的研究具有重要的理論和實(shí)際意義。

綜上所述，本研究通過耗氧率、排氨率以及4種免疫相關(guān)酶活性的變化情況對(duì)紅嬌鳳凰螺的耐鹽性進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，鹽度脅迫提高了紅嬌鳳凰螺肝胰臟CAT、肌肉POD活性，降低了耗氧率、排氨率，并造成LZM活性降低，導(dǎo)致紅嬌鳳凰螺殺滅和消化細(xì)菌的能力降低。目前鹽度對(duì)海洋無脊椎動(dòng)物免疫力影響的機(jī)理尚不清楚，無脊椎動(dòng)物非特異性免疫系統(tǒng)是如何應(yīng)對(duì)病原體侵染、如何進(jìn)行應(yīng)激性調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及是否存在其他物質(zhì)的參與和協(xié)調(diào)等尚需深入研究[33-34]。