李興航 綜述，李琦涵 審校

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，云南 昆明 650118

1973年，STEINMAN和COHN［1］在小鼠脾細胞中發(fā)現(xiàn)一群形態(tài)上呈獨特星形的細胞群，命名為樹突狀細胞（dendritic cell，DC）。之后的研究發(fā)現(xiàn)，DC是一類抗原提呈細胞（antigen-presenting cell，APC），在啟動機體免疫應答和維持免疫耐受方面發(fā)揮重要作用，并在天然免疫和適應性免疫中起著橋梁的作用。鑒于其在免疫功能的特殊地位，DC疫苗的研究可為常規(guī)疫苗無法治療的疾?。ㄈ缒[瘤）提供新的治療手段，也可為開發(fā)新型預防性疫苗提供思路。本文基于DC疫苗的研究現(xiàn)狀和前景作一綜述。

1 DC的分類和生物學功能

DC是一種獨特的APC，存在于不同的解剖位置和環(huán)境間，如皮膚真皮層、淋巴結等。能夠捕獲、處理并提呈抗原，具有激活Naive T細胞、CD4+T和B細胞的能力，啟動免疫應答［2］。

DC根據成熟度不同，可分為成熟和未成熟DC。未成熟DC能夠高效的從周邊環(huán)境中攝取病原體、死亡的細胞和其他抗原物質，并對其進行處理加工。這類DC表面的MHCⅠ和MHCⅡ以及T細胞共刺激因子和黏附分子的表達水平均較低，將抗原提呈并激活T細胞的能力有限，但可通過誘導T細胞無能和T細胞耗盡誘導免疫耐受［3-4］。成熟DC的攝取抗原能力下降，但MHC分子、共刺激分子和黏附分子（如CD40、CD80、CD83、CD54等）表達增加，此外還會分泌和表達一些細胞因子（如IL-6、TNF-α、干擾素）和趨化因子受體（如CCR7）［5］。這些分子能將DC順利趨化至外周淋巴器官與T細胞進行作用，從而能夠將抗原提呈給T細胞啟動抗原特異性免疫應答。

根據DC的發(fā)育過程不同，主要分為經典DC（cDC）、漿細胞樣DC（pDC）和單核細胞來源DC（mo-DC），其功能、分布和表面標志物見表1和表2［6］。常規(guī)樹突狀前體細胞（pre-cDC）、pDC和單核前體細胞來源于骨髓，通過血液循環(huán)遷移至淋巴結、脾等淋巴組織和皮膚、肺、腸等非淋巴組織。在皮膚等外周組織中，pre-cDC和單核前體細胞分別分化為未成熟的cDC和moDC［7］。此外，朗格漢斯細胞（Langerhans cells，LC）也屬于皮膚表皮中的一類特殊的常駐抗原提呈細胞群體，可將抗原提呈給CD4+T細胞誘導Th2型免疫應答。此前大部分文獻認為LC屬于DC中的一類，但LC在個體發(fā)育上明顯不同于DC［8-9］，其來源于胚胎的單核細胞，并能夠自我更新，另外LC的發(fā)育依賴于巨噬細胞生長因子CD115／M-CSF-R和IL-34，并不依賴于Flt3L?；谝陨线@些特點，LC在最新的一些報道中被被歸納為巨噬細胞群體［10-11］。

表1 人和小鼠體內DC亞群分類Tab.1 Classification of DC subsets in humans and mice

表2 人和小鼠體內DC亞群主要功能特點Tab.2 Main functional features of DC subsets in humans and mice

另外還有一類天然淋巴細胞（innate lymphoid cell，ILC）與DC在機體天然免疫和誘導T細胞應答中具有高度相似之處。ILC、DC和T細胞構成4個功能性的免疫模塊，并協(xié)同相互作用共同激活T細胞應答［12-13］。ILC1、cDC1和Th1細胞屬于細胞內防御模塊；ILC2和由轉錄因子Klf4定義的cDC2亞群與Th2細胞對維持屏障免疫具有重要作用；ILC3和依賴于Notch2的cDC2亞群對細胞外病原體和真菌的免疫是必需的［12］。此外，兩類細胞發(fā)育的祖細胞和轉錄譜均有相同之處［13］。

DC不僅能通過抗原依賴的方式啟動特異性免疫應答，還能誘導免疫耐受，調節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)［14］。理解不同DC亞群的功能特征和與之相關的免疫應答網絡，也為各類疾病以及針對這些疾病的疫苗的免疫學研究奠定了理論基礎。

2 DC疫苗

DC以其強大的抗原攝取、加工和提呈的能力以及在激活機體免疫應答中的重要地位，成為研究疫苗的理想對象。目前，全世界進行的關于DC疫苗的臨床試驗已超過200項（數據來源：https：／／clinicaltrials.gov）。

2.1 DC疫苗的分類DC疫苗根據研究時間和制備策略的不同大致可分為3類［15］：①早期DC疫苗，即使用蛋白質或長肽形式的抗原加上促進DC成熟的佐劑［16］；②體內靶向DC的疫苗；③體外誘導DC負載抗原后回輸。

傳統(tǒng)DC疫苗的靶向性較差。為增強其靶向性，需尋找和使用與DC具有高親和力的載體或尋找關于DC的新型佐劑。靶向DC疫苗是通過將抗DC表面相關受體（如DC表面的C型凝集素DEC205、CD11c等）的抗體與抗原偶聯(lián)后注射進入機體，使抗原能夠直接與DC接觸。體外DC負載抗原后回輸是通過從人體的外周血分離單個核細胞或從骨髓分離CD34+前體細胞后，經多種細胞因子（如GM-CSF、IL-4、TNF-α）進行刺激分化，獲得未成熟或成熟DC。這些DC可在負載核酸、多肽、蛋白、細胞、納米顆粒等抗原后回輸至受者體內。在體內，DC將這些物質作為抗原攝取、加工和提呈給機體免疫系統(tǒng)，誘導或增強人體針對相關抗原的免疫應答，達到預防或治療疾病的作用。

2.2 早期DC疫苗 早期的DC疫苗就是通常所說的重組蛋白或多肽疫苗，其研究重點在抗原肽序列的合理設計和佐劑的運用上。該概念是基于MHC分子在提呈抗原肽中所起作用的研究提出的。此前，學界廣泛認為MHCⅠ類分子結合肽段稍長的肽，在合適佐劑的作用下，能夠更好地使DC促進效應T細胞的活化，另外一些長肽包含可由DC提呈的更廣泛的表位，促進DC對抗原的提呈效果［16］。

LEFFERS等［17-18］開展了一項針對TP53蛋白設計的腫瘤疫苗p53-SLP的臨床試驗，該疫苗通過構建重疊的合成長肽（synthetic long peptide，SLP）促進疫苗被DC提呈。p53-SLP能夠誘導p53特異性T細胞反應，但誘導的IFNγ T細胞和Th1細胞反應較弱，受試者生存率與其他患者無顯著差異，需要進一步優(yōu)化疫苗的設計［16］。另外，葛蘭素史克研發(fā)了一款針對非小細胞肺癌患者的疫苗并開展了Ⅲ期臨床試驗。該疫苗使用癌睪丸抗原3（melanomaassociated antigen-3，MAGEA-3）的重組融合蛋白，配合佐劑AS15。臨床試驗結果顯示，與安慰劑相比，該疫苗并未增加受試者生存期，因此停止了該疫苗的進一步研發(fā)［19］。

早期DC疫苗的失敗，可能是對DC在提呈抗原激活免疫和誘導耐受方面的功能了解不夠全面。另外，缺乏有效的DC激活佐劑可能會導致DC保持未激活狀態(tài)或誘導耐受。為解決這些問題，人們開始開發(fā)靶向DC疫苗或將DC負載抗原后回輸來保證DC的激活和對抗原的提呈。

2.3 靶向DC疫苗 靶向DC疫苗的原理是通過將DC表面受體的抗體與需要遞送的抗原偶聯(lián)或融合在一起，使疫苗本身能夠更加高效地被DC攝取、加工和提呈。這些靶向受體包括DEC205、Clec9A、Clec12A、CD11c、CD40、CD11b等［20］。有研究顯示，疫苗靶向DC表面不同受體會具有不同被內化的效率，一般情況下，DEC205、Clec9A、CD40較CD11b和CD11c具有更好的內化速度。另外，抗原量的多少并不是抗原提呈效率的決定因素［21］。因此，在靶向DC疫苗中選擇合適的靶向受體至關重要。目前，靶向DC疫苗已針對多種腫瘤、流感病毒、輪狀病毒、HIV、HPV等多種疾病和病原體進行了研究［22-26］。

這些受體中，在小鼠和人類中研究最廣泛的DC靶標為DEC205。PADILLA-QUIRARTE等［25］將流感病毒M節(jié)段中的M2e與DC表面DEC205（α-DEC-205：M2e）用特異性單克隆抗體（mAb）進行化學交聯(lián)，加入polyI：C佐劑后皮下免疫小鼠，對照組僅免疫M2e蛋白或M2e游離肽。實驗組雖無法阻止動物發(fā)病，但對病毒劑量30 LD50的異源性病毒的致死性攻擊具有76%的保護效果，而對照組僅20%～40%。另一項研究用輪狀病毒VP6與DEC205的mAb交聯(lián)（αDEC-205：VP6），并使用polyI：C作為佐劑，口服免疫小鼠。相比僅用VP6免疫，αDEC-205：VP6能更早誘導出抗VP6抗體。免疫后21 d對小鼠進行口服攻毒發(fā)現(xiàn)，αDEC-205：VP6組在第2天，排泄出的輪狀病毒較對照組開始減少，至第6天完全檢測不到，表明αDEC-205：VP6能顯著降低病毒在腸道內的復制［24］。

一些研究還通過將DC靶向肽與抗原融合構建DC靶向疫苗。WANG等［27］通過重組植物乳桿菌NC8并攜帶狂犬病病毒數個G基因，在肽段的C-末端融合DC靶向肽（DCpep）組成疫苗NC8-pSIP409-dRVG。經過3次1×109CFU劑量口服免疫后的小鼠，具有高水平的IgG抗體并具有強烈的Th1型免疫應答，能夠保護60%小鼠免受病毒劑量為100×ICLD50（100倍50%腦內致死劑量）的致死性攻擊。

最新研究發(fā)現(xiàn)，可構建蛋白融合系統(tǒng)實現(xiàn)疫苗的DC靶向。AO等［28］開發(fā)了一種基于埃博拉病毒包膜糖蛋白（EboGP）的嵌合融合蛋白系統(tǒng)，并用該系統(tǒng)開發(fā)出一款HIV疫苗。研究者們用HIV包膜多肽（Env）的C2-V3-C3或C2-V3-C3-V4-C4-V5替換EboGP黏蛋白樣結構域（mucin-like domain，MLD）的MLD-C5環(huán)肽（分別為EbGPΔM-V3和EbGPΔM-V3-V5）構建HIV的DC靶向系統(tǒng)。結果表明，V3多肽的替代不影響EboGPΔM靶向DC的能力，并能有效刺激NF-κB信號通路。EboGPΔM-V3結合HIV的VLPs和Env，能夠誘導小鼠產生高水平的針對HIVgp120和p24的IgA、IgG抗體以及較強的IFNγ、IL-2、IL-4、IL-5和MIP-1水平。證明了該靶向DC疫苗技術平臺的可行性。

2.4 DC體外負載抗原后回輸 這類DC疫苗的策略在于通過體外誘導未成熟或成熟DC后，針對不同抗原類型，通過多種手段（如共孵育、細胞融合、轉染等）將抗原負載至DC上，最后回輸至人或動物體內完成免疫，達到預防或治療疾病的作用［29-30］，簡要流程見圖1。

針對細胞類抗原，DC可通過直接攝取死細胞和細胞裂解產物達到負載抗原的目的，也可通過聚乙二醇或電融合法將活細胞與DC融合形成融合細胞。該策略的優(yōu)勢是具有大量的表位信息，可激活多種針對腫瘤抗原的T細胞產生免疫應答，但數量較多的抗原類型也可能同時會激活自身反應性T細胞導致自身免疫疾病。

針對蛋白和肽類抗原，普遍是將DC與多肽和蛋白共孵育，使DC直接攝取加工后回輸體內。如將腫瘤的腫瘤特異性抗原（tumor-specificantigen，TSA）或腫瘤相關性抗原（tumor-associatedantigen，TAA）負載至DC上治療腫瘤，或通過將病原體如SARSCoV-2的S蛋白負載至DC上回輸，可用于預防或治療COVID-19。

針對核酸類抗原，可通過病毒載體、脂質體轉染、電轉染法和共孵育方法將核酸疫苗導入DC內。目前普遍通過脂質體或電轉染方法將核酸導入DC內，較少采用共孵育方法，因為該方法效率較低［29］。對于核酸類型，目前多數疫苗更傾向于mRNA的DC疫苗，因為mRNA不會整合至細胞基因組中，帶來的安全性考慮會更少。

針對納米材料，一般通過調節(jié)納米顆粒粒徑或對納米材料進行修飾后。在納米顆粒上搭載蛋白或核酸類的抗原物質后負載DC制成疫苗。納米材料的選擇包括無機物和有機物，無機納米材料如納米金顆粒、氧化鐵納米顆粒，有機納米材料如一些多肽類納米纖維、殼聚糖等。如一種經美國食品和藥物管理局（FDA）批準的納米顆粒PLGA，是一種生物降解緩釋聚合物，該納米顆粒易被DC吸收［31］。

目前，這一類DC疫苗在預防和治療傳染性疾病和惡性腫瘤的研究中備受關注。2010年4月，F(xiàn)DA批準了世界上第一款DC疫苗“Sipuleucel-T”上市，用于臨床上治療轉移性前列腺癌［32］。Sipuleucel-T是通過收集患者的血液后，用白細胞去除術富集DC前體細胞后，在細胞因子GM-CSF的存在下與前列腺酸性磷酸酶（prostate acid phosphatase，PAP）共孵育36～44 h，DC負載抗原后，回輸給患者。臨床試驗發(fā)現(xiàn)，該疫苗將患者中位總生存期提高了約4個月，與安慰劑相比具有顯著差異［33］。盡管該疫苗的總體療效并未達到治愈疾病的目的，但對于DC疫苗的發(fā)展具有重要意義。

在治療性DC疫苗上，近年來基于上述策略的DC疫苗在臨床中對于治療肺癌［34］、乳腺癌［35］、結腸癌［36］、膠質母細胞瘤［37］、肝癌［38］等多種實體瘤和血液?。?9］均有突破性進展。在預防性DC疫苗上，研究者也試圖開始用DC疫苗預防COVID-19［15］。部分DC疫苗的臨床研究信息見表3，數據來源于https：／／clinicaltrials.gov。

表3 部分DC負載抗原的臨床研究Tab.3 Clinical study of partial antigens loaded on DCs

3 DC疫苗的挑戰(zhàn)及前景

3.1 DC亞群的選擇 由于DC在體內的稀缺性，目前許多DC疫苗選擇使用的是由PBMC通過細胞因子誘導而來的MoDC。但MoDC似乎達不到預期效果，推測是因為MoDC遷移至淋巴結能力有限；此外MoDC對于具備激活哪一類T細胞的能力有待確認［40］。一些研究表明，使用MoDC疫苗后，T細胞的啟動實際上需要內源性DC［41］。目前已有多項在鼠和人體上的研究使用了cDC1或cDC2等。如TAY等［42］通過誘導出CD133+DC負載腫瘤mRNA后用于治療乳腺癌的研究中，在小鼠體內獲得了較好的效果。ZHOU等［43］通過誘導CD103+cDC，較MoDC顯示出更好的對骨肉瘤的療效，與CTLA-4免疫檢查點療法結合可獲得100%腫瘤消退的效果。此外，CD8+cDC1、CD11b+cDC2和pDC也均有相關的研究［44-47］。因此，不同亞群DC似乎可在疾病的預防和治療中起不同的作用，但究竟選擇何種DC亞群目前仍需進一步研究。

3.2 靶點的選擇 目前DC疫苗的制備，可選擇單一表位（如SARS-CoV-2 S蛋白），也可聯(lián)合多種表位或直接選擇腫瘤總mRNA或腫瘤細胞裂解物進行DC負載。選擇合適的疫苗靶點對疾病的預防和治療至關重要，但對于一些腫瘤以及病毒感染性疾?。ㄈ鏗CV）尚無非常明確的靶點。選擇疾病靶點過多可能引發(fā)自身免疫疾病，過少則有可能療效有限或是無效靶點。目前很多工作（如腫瘤新抗原的尋找）也正希望突破這個難點。如果未來尋找到有效、明確的疾病靶點應用至DC疫苗將推動其快速發(fā)展。

3.3 遞送系統(tǒng)的選擇和優(yōu)化 在體外誘導DC的過程中，不同種類和不同劑量的細胞因子培養(yǎng)出的DC表型上具有很大差異。這些DC遷移至淋巴結的能力和對下游T細胞的刺激能力均不同。如經誘導產生的未成熟DC因MHCⅠ和MHCⅡ等共刺激分子表達較低，無法較好激活T細胞。此外，DC的遷移能力與體內的細胞因子、細胞表面CCR7等受體密切相關。通過不同細胞因子組合可促進DC表面CD83和CCR7的高表達，同時具備分泌IL-12p70的能力［48］。另外有研究通過在疫苗注射部位上使用破傷風類毒素預處理后，增強DC以依賴于CCL3的方式發(fā)生趨化作用［49］。另外，不同的遞送方式（皮內、皮下、靜脈）也會有不同的結果。皮內和皮下遞送方式，DC會遷移至引流淋巴結中，但遷移率僅在5%左右［50-51］；靜脈遞送方式，DC會集中在肝、脾、腎等組織器官，但療效較差［52］。

3.4 DC疫苗產業(yè)化的困難 由于DC在人體內的稀少性和不同個體間的免疫排斥，DC疫苗的制備均需個性化的獨家定制，這給DC疫苗的普及帶來諸多問題。與其他個性化治療一樣，DC疫苗的費用非常昂貴，Sipuleucel-T的每個療程高達9萬多美元。因此，該疫苗的可及率非常低。另外，在GMP條件下對自體DC進行高效的擴增和誘導、保證DC疫苗的一致性和標準化、建立DC疫苗的評價標準等難題，均在DC疫苗的產業(yè)化上亟待解決［53-54］。

4 小結

DC作為唯一能激活初始T細胞的抗原提呈細胞，其在機體的免疫過程中至關重要。過去二十年間，DC疫苗的研究取得了重大進展，DC疫苗也在不斷進行細化和優(yōu)化以獲得更好的遷移能力和免疫效果。然而，目前對于DC功能、疾病發(fā)生的機制和靶點的了解有限，DC疫苗想要取得突破性進展仍需對這些基礎理論進行更加深入和詳細的探討。繼續(xù)進行對DC參與的免疫調控網絡中其他細胞在免疫過程中的研究，如ILC、巨噬細胞，也可為DC疫苗的設計提供新的參考。綜上所述，DC疫苗是近年來備受關注的一類新型疫苗，能從抗原提呈的角度進行疾病的預防和治療，具有極大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>