秦天琦,吳愫青（廣東省珠海市食品藥品檢驗所,廣東 珠海 519090）

碳酸鈣D3片為復(fù)方制劑，含有碳酸鈣和維生素D3兩種主要的有效成分。鈣元素是維持人體神經(jīng)、肌肉、骨骼系統(tǒng)、細(xì)胞膜和毛細(xì)血管通透性等正常生理功能所必需的。維生素D3是自然存在的一種脂溶性維生素，屬于類固醇類激素，維生素D3的基本功能是參與體內(nèi)鈣、磷代謝，促進(jìn)腸道鈣、磷吸收，調(diào)整鈣、磷吸收比例，促進(jìn)骨的鈣化和正常發(fā)育[1]。碳酸鈣D3片臨床上主要用于妊娠和哺乳期婦女、更年期婦女、老年人等的鈣補充，并用于預(yù)防與治療佝僂病、中老年骨質(zhì)疏松癥，另有文獻(xiàn)報道維生素D3對老年高血壓亦有協(xié)同治療作用[2]。

因制劑中維生素D3含量較低，準(zhǔn)確測定制劑中維生素D3的含量尤為重要，目前已有的三個標(biāo)準(zhǔn)：《國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH05962009》《國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-002)-2008Z-2012》《GB 5009.82-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素 A，D，E的測定》，均對如何提取分離并準(zhǔn)確測定制劑中的維生素D3作了相關(guān)的規(guī)定，本文參考三個標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，分別采用萃取后真空旋蒸至干復(fù)溶法、有機溶劑提取法、皂化法三種方法提取分離碳酸鈣D3片中的維生素D3，然后分別采用反相高效液相色譜法、正相高效液相色譜法、在線固相萃取-二維液相色譜方法三種方法測定維生素D3的含量。

1 儀器與試藥

1.1試劑與藥品 藥品：碳酸鈣D3片（北京振東康遠(yuǎn)制藥有限公司提供；批號：20201056），對照品：維生素D3（中檢院提供，批號：100061-201208，含量：99.8%，干燥：無），試劑：異丙醇、氨水、無水乙醇、環(huán)己烷、無水硫酸鈉、氯化鈉、乙腈（HPLC）、甲醇（HPLC）、二甲基亞砜、正己烷（HPLC）、異丙醇（HPLC）、抗壞血酸、2,6-二叔丁基對甲酚（簡稱BHT）、氫氧化鉀。

1.2儀器與色譜柱 儀器：電子分析天平（METTLER TOLEDO XPE206DR）；超高效液相色譜儀（Agilent 1260 prime）；高效液相色譜儀（Agilent 1260）；超聲波清洗器（Elma P300H）；水浴鍋（Julabo CORIO CD）；低速臺式離心機（Anke TDL-50C）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA RV10 Auto pr）。

色譜柱：反相色譜法色譜柱：Welch Ultimate LP-C18，4.6×150mm，5μm，SN：60201 201105；正相色譜法色譜柱：Welch Ultimate SiO2，4.6×250mm，5μm，SN：60210 301071；在線固相萃取-二維液相色譜方法色譜柱：SPE柱：Agilent PLRP-S，4.6×12.5mm，15-20μm（5982-1270）；1D分析柱：Agilent Poroshell 120 EC-C8，4.6×100mm，4 μm（695970-906）；捕獲柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18，4.6×5mm，4 μm（820750-916）；2D分析柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus PAH，2.1×100mm，3.5 μm（959793-918）。

2 實驗部分

2.1提取分離維生素D3

2.1.1萃取后真空旋蒸至干復(fù)溶法 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗：維生素D3峰與前維生素D3峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。

前維生素D3相對校正因子測定：避光操作。取維生素D3對照品約20mg，精密稱定，置200ml量瓶中，加異丙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加異丙醇至刻度，搖勻；另精密量取對照品貯備溶液5ml，置250ml回流瓶中，加異丙醇20ml，于95℃水浴中回流1小時，40℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，精密加入異丙醇100ml，振搖使溶解。精密量取上述二種溶液各20μl注入液相色譜儀中，計算前維生素D3折算成維生素D3的相對校正因子（f=(A1-A2)/(A3-A4)）。

式中：A1為熱破壞前維生素D3的峰面積；A2為熱破壞后維生素D3的峰面積；A3為熱破壞后前維生素D3的峰面積；A4為熱破壞前前維生素D3的峰面積。

供試品溶液：避光操作。取本品1片，置250ml具塞量筒中，加0.3%氨水溶液，振搖使崩解，置90℃-100℃水浴中，加熱振搖15秒，取出，具塞，振搖45秒，再重復(fù)上述操作2次。加無水乙醇至60ml，振搖10秒鐘，精密加入環(huán)己烷100ml，振搖1分鐘，加水50ml，振搖2分鐘，靜置使分層（若乳化，可加入氯化鈉適量破乳），取環(huán)己烷層，經(jīng)無水硫酸鈉濾過，精密量取續(xù)濾液50ml，置150ml回流瓶中，40℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，精密加入異丙醇2ml，振搖使溶解。

對照品溶液：精密稱取維生素D3對照品適量，加異丙醇溶解并定量稀釋制成每1ml中約50IU的溶液，同法測定。

2.1.2有機溶劑提取法 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗：維生素D3的拖尾因子不得大于2.0。取對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，維生素D3峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于3.0%；另取對照品儲備液Ⅱ適量，在55℃水浴中加熱1小時，放冷，取該溶液40μl注入液相色譜儀，維生素D3前體峰與維生素D3峰之間的分離度應(yīng)大于3.0。

供試品溶液：取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于維生素D3250IU），置50ml離心管中，加入75%二甲亞砜水溶液約20ml，密塞搖勻，將離心管置于45℃±5℃水浴超聲15分鐘，并不時振搖，放冷。精密加入用75%二甲亞砜水溶液處理過的正己烷（75%二甲亞砜水溶液和正己烷按1∶20進(jìn)行混勻后，取正己烷層）15ml，振搖90分鐘，3000rpm離心10分鐘，取上清液作為供試品溶液。

對照品溶液：精密稱取維生素D3對照品（40000IU/mg）約25mg，置100ml量瓶中，加上述75%二甲亞砜水溶液處理過的正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液Ⅰ。精密量取對照品儲備液Ⅰ5ml，置100ml量瓶中，加上述75%二甲亞砜水溶液處理過的正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液Ⅱ。再精密量取對照品儲備液Ⅱ5ml，置100ml量瓶中，加上述75%二甲亞砜水溶液處理過的正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

精密量取供試品溶液和對照品溶液各40ml，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。取上述75%二甲亞砜水溶液處理過的正己烷作為空白溶液，同法進(jìn)樣，以消除對含量測定的干擾。按下式計算維生素D3的總量：維生素D3總量=維生素D3含量+維生素D3前體含量=維生素D3含量×1.09。

2.1.3皂化法 供試品溶液：取本品1片置于圓底燒瓶中，加入20ml的水振搖使溶解，混勻，再加入1.0g抗壞血酸和0.1gBHT，混勻，加入30ml的乙醇和10-20ml的氫氧化鉀溶液（50g KOH/50g水），混勻后于80℃恒溫水浴皂化30min。皂化后冷卻至室溫，用乙醇∶水=1∶1轉(zhuǎn)移定容至100ml。取適量皂化液，先高速離心10min（＞5000rpm），再用0.22μm的針式濾器過濾（尼龍濾膜，5190-5271）至進(jìn)樣瓶中，待測。

對照品溶液：精密稱取維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，用無水乙醇溶解后，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶定容，精密量取0.5ml于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，再精密量取1ml于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻（VD3：0.05μg/ml）。

2.2維生素D3含量測定

2.2.1反相高效液相色譜法 采用Agilent超高效液相色譜儀，以十八烷基鍵合硅膠為填充劑（色譜柱: Welch Ultimate LPC18，4.6×150mm，5μm，SN：60201201105），以乙腈-甲醇（9∶1）為流動相，流速為1 ml/分鐘，檢測波長為265nm，進(jìn)樣量為20μl，記錄色譜圖。

2.2.2正相高效液相色譜法 采用Agilent高效液相色譜儀，以硅膠為填充劑（色譜柱: Welch Ultimate SiO2，4.6×250mm，5μm，SN：60210301071），流速為1.0 ml/分鐘，檢測波長為265nm，進(jìn)樣量為40μl，以含0.45%（V/V）異丙醇的正己烷溶液為流動相A，以含20%（V/V）異丙醇的正己烷溶液為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，記錄色譜圖。

2.2.3在線固相萃取-二維液相色譜方法 采用Agilent高效液相色譜儀，按下面步驟確定維生素D3分析方法。

第一步：流路連接，見圖1。

第二步：確定維生素D3的切割窗口。根據(jù)色譜條件（表2）按順序分別進(jìn)一針空白溶液，兩針對照品溶液，保證保留時間重復(fù)性后，得到維生素D3的保留時間。

表2 維生素D3系統(tǒng)驗證分析方法

第三步：建立完整的維生素D3分析方法。根據(jù)結(jié)果確定維生素D3捕獲窗口并編輯閥2的切換時間。切換開始時間為維生素D3峰起始時間減去0.1min，切換結(jié)束時間為維生素D3峰回到基線時間加0.1min。其余條件與表2條件一樣，得到完整的維生素D3分析方法（見表3所示）。用該方法再進(jìn)一針對照品溶液，可以在1D檢測器和2D檢測器分布得到維生素D3色譜圖。

表3 維生素D3完整分析方法

3 實驗結(jié)果分析

3.1萃取后真空旋蒸至干復(fù)溶法-反相高效液相色譜法

3.1.1系統(tǒng)適用性 按2.1.1所述方法，制備熱破壞后的維生素D3對照品溶液，精密吸取溶液按照2.2.1所述色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖2。結(jié)果表明，維生素D3峰（保留時間17.531min）與前維生素D3峰（保留時間16.472min）的分離度符合藥典規(guī)定的要求（1.6）。

圖2 系統(tǒng)適用性色譜圖

3.1.2含量測定結(jié)果 取供試品共10份，依法測定結(jié)果，并計算相對平均偏差。10份樣品的平均含量為108.6%，在藥典規(guī)定的范圍內(nèi)（90.0%-122.5%），相對平均偏差為1.8%。

3.2有機溶劑提取法-正相高效液相色譜法

3.2.1系統(tǒng)適用性 按2.1.2所述方法，制備系統(tǒng)適用性溶液，精密吸取系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，按照2.2.2所述色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖3。結(jié)果表明，維生素D3的拖尾因子不大于2.0（1.3），取對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，維生素D3峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于3.0%（0.4%），維生素D3前體峰（保留時間16.733min）與維生素D3峰（保留時間28.004min）之間的分離度大于3.0（17.2）。

圖3 系統(tǒng)適用性色譜圖

3.2.2含量測定結(jié)果 取供試品共2份，依法測定結(jié)果，并計算相對平均偏差。2份樣品的平均含量為102.3%，在藥典規(guī)定的范圍內(nèi)（90.0%-122.5%），相對平均偏差為0.6%。

3.3皂化法-在線固相萃取-二維液相色譜方法

3.3.1系統(tǒng)適用性 按2.1.3所述方法，制備對照品溶液，精密吸取對照品溶液，按照2.2.3所述色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖4。結(jié)果表明，維生素D3出峰時間為21.899min，且與相鄰峰分離良好。

圖4 系統(tǒng)適用性色譜圖

3.3.2測量線性與范圍 按2.1.3所述方法，制備不同濃度的對照品溶液（0.005μg/ml、0.0125μg/ml、0.025μg/ml、0.05μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml），以測得的響應(yīng)信號（峰面積）對被分析物濃度的函數(shù)作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，線性相關(guān)系數(shù)r2=0.993，線性關(guān)系良好。

圖5 維生素D3含量測定線性范圍

3.3.3含量測定結(jié)果 取供試品共2份，依法測定結(jié)果，并計算相對平均偏差。2份樣品的平均含量為103.5%，在藥典規(guī)定的范圍內(nèi)（90.0%-122.5%），相對平均偏差為1.0%。

4 討論

碳酸鈣D3片中維生素D3含量很低，一直以來其分析過程操作繁瑣，樣品回收重現(xiàn)性差。碳酸鈣D3片是臨床大量使用的一種鈣補充劑，對其準(zhǔn)確定量意義顯著。本文采用了三種方法提取分離并測定碳酸鈣D3片中的維生素D3含量，三種方法測定的含量結(jié)果分別為108.6%、102.3%、103.5%，均在藥典規(guī)定的范圍內(nèi)，三種提取方法均滿足對碳酸鈣D3片中維生素D3測定的前處理要求，其中真空旋蒸至干復(fù)溶法，提取過程復(fù)雜，耗時費力，有機溶劑提取法，耗費大量有機試劑，和目前提倡的環(huán)境保護(hù)理念不相適應(yīng)。而本文中使用的皂化法前處理步驟最方便快捷，相對于《GB 5009.82-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素 A，D，E的測定》中采用的提取方法，簡化了提取步驟，避免了大量破壞環(huán)境有機試劑的使用，配合使用在線固相萃取-二維液相色譜方法測定含量，效率更高、準(zhǔn)確度更好，此方法更適用于碳酸鈣D3片中維生素D3含量的測定。

近年來，在線固相萃取-二維液相色譜技術(shù)以峰容量大、基質(zhì)效應(yīng)低、分析通量高等特點被廣泛應(yīng)用于食品檢測行業(yè)中[3]，但在藥物檢測中的應(yīng)用相對較少?！吨袊幍洹?020年版四部（通則0722）對維生素D的前處理須通過皂化、提取、分離、液相收集等步驟，這種前處理方式較為繁瑣，不適合處理大量樣品，而且對實驗人員的操作水平也有較高要求。本文中采用的分析方法將樣品溶液皂化后經(jīng)簡單定容便可直接進(jìn)行檢測，進(jìn)樣后樣品溶液經(jīng)第一個六通閥，通過在線固相萃取小柱凈化，凈化液進(jìn)入一維色譜，一維色譜采用C8色譜柱，進(jìn)行初步分離，根據(jù)維生素D3在一維色譜上的出峰時間，確定切換時間，將這一段時間內(nèi)的流出液經(jīng)另一個六通閥上的捕獲柱富集，轉(zhuǎn)入二維色譜進(jìn)一步分離，實現(xiàn)對維生素D3的快速測定[4-5]。此方法不僅可以用于制劑中維生素D3的檢測，還可以用于復(fù)合維生素片中維生素A、維生素D2、維生素D3、維生素E的分離檢測。在線固相萃取-二維液相色譜技術(shù)作為一種高效的分離分析手段，與傳統(tǒng)的定量方法相比，該柱切換系統(tǒng)無需繁瑣的制備過程，大大提高了分析效率，該技術(shù)在嬰幼兒配方食品、配方乳制品中維生素A、D、E的實際檢測應(yīng)用方面已經(jīng)取得了較好的效果，也為復(fù)合維生素片中維生素A、D、E的含量測定提供了新思路和新參考。但是，二維液相色譜儀器的價格昂貴且維護(hù)成本較高，導(dǎo)致該技術(shù)在維生素A、D和E檢測中的應(yīng)用方面受到了局限，多用于研究性領(lǐng)域，另外對于復(fù)雜制劑中維生素A、D、E和其他脂溶性維生素的檢測還有待于更深入的研究和開發(fā)。未來，隨著二維液相色譜的不斷發(fā)展完善，以及應(yīng)用面的擴(kuò)大和經(jīng)驗的積累和總結(jié)，這一技術(shù)將具有良好的應(yīng)用前景。