王春暉，楊逸露，曹碧紅，車玉傳，吳顯勁△

1.廣東省惠州市中心人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心，廣東惠州 516001；2.廣東醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東湛江 524002

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)于2019年12月在不明原因肺炎患者中被發(fā)現(xiàn)，該病毒能引起新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)[1]。有研究顯示，相較于普通肺炎患者，COVID-19患者血清炎癥因子水平增高,如白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-2R、IL-6、IL-7、IL-10、粒細(xì)胞集落刺激因子(GSCF)和干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(IP-10)等，病情嚴(yán)重者可發(fā)生“細(xì)胞因子風(fēng)暴”。很多COVID-19重型患者的死亡是由于“細(xì)胞因子風(fēng)暴”引起的嚴(yán)重并發(fā)癥如急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)及多器官功能障礙綜合征[2-3]。目前臨床上對于“細(xì)胞因子風(fēng)暴”尚無特異性治療手段，如何在疾病早期階段控制“炎癥風(fēng)暴”，防止患者病情迅速惡化成為臨床治療有效的關(guān)鍵。IL-35是IL-12家族的最新成員，由IL-12p35和EBI3β鏈組成的異質(zhì)二聚體，是一種免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，在多種免疫相關(guān)疾病(如自身免疫疾病、病毒和細(xì)菌感染)以及腫瘤中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4-5]。IL-37是新發(fā)現(xiàn)的IL-1家族成員，是機(jī)體內(nèi)有效的炎癥抑制因子，有證據(jù)表明其在炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[6-7]。然而，IL-35、IL-37的表達(dá)是否在COVID-19患者“炎癥風(fēng)暴”的轉(zhuǎn)歸中起關(guān)鍵性作用有待進(jìn)一步研究。本課題組分析了惠州市中心人民醫(yī)院收治的COVID-19患者的臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測數(shù)據(jù)，另外還檢測了患者血漿IL-35、IL-37水平，旨在探討COVID-19患者細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡偏移的機(jī)制及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2020年2-4月在惠州市中心人民醫(yī)院感染科隔離病區(qū)住院的45例COVID-19患者(均為輕型或普通型)納入研究，其中男21例(46.7%)、女24例(53.3%)，年齡(44.22±18.85)歲。收集上述人群的臨床資料和實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢測數(shù)據(jù)。患者納入標(biāo)準(zhǔn)(需同時(shí)滿足以下2項(xiàng))[8]：(1)有流行病學(xué)史的COVID-19疑似病例；(2)鼻咽拭子等標(biāo)本行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示為病毒RNA陽性。采集研究對象不同時(shí)期外周靜脈血標(biāo)本，包括2 mL EDTA-K2抗凝全血和5 mL肝素鋰抗凝全血。按采樣時(shí)期分為疾病早期(住院首次抽血檢測)、中期和恢復(fù)期(癥狀好轉(zhuǎn)出院前)3組。EDTA-K2抗凝全血標(biāo)本用于血常規(guī)項(xiàng)目檢測；肝素鋰抗凝血采用低速離心，收集血漿用于細(xì)胞因子檢測。如血漿無法及時(shí)檢測，則置于-70 ℃保存。另外，選取30例體檢健康者作為對照組，其中男12例(40.0%)、女18例(60.0%)，年齡(38.53±14.32)歲。患者組和對照組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院臨床科研倫理委員會批準(zhǔn)，并且獲得患者知情同意。

1.2方法 血常規(guī)檢測采用日本Sysmex全自動(dòng)血液分析儀XN3000及配套試劑檢測，收集的實(shí)驗(yàn)室檢測數(shù)據(jù)包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(NEUT)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LYMPH)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)等；血漿細(xì)胞因子(IL-35、IL-37)檢測采用的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自美國OmnimAbs公司，檢測儀器為深圳市匯松科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的多功能酶標(biāo)儀MB-580。所有儀器使用和檢驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和試劑說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1血常規(guī)檢測 與對照組比較，患者組各期外周血WBC、LYMPH減少(P<0.05)，而NEUT、PLT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。患者經(jīng)治療后，恢復(fù)期WBC、LYMPH較疾病早期和疾病中期增加(P<0.05)。

表1 COVID-19患者不同時(shí)期血常規(guī)參數(shù)檢測結(jié)果[M(P25～P75),×109/L]

2.2血漿細(xì)胞因子檢測 各組間IL-35、IL-37水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。患者組疾病早期和恢復(fù)期IL-35水平均低于對照組(P<0.05)，IL-37水平均高于對照組(P<0.05)；隨著病情好轉(zhuǎn)，患者組恢復(fù)期IL-37水平低于疾病早期(P<0.05)，而恢復(fù)期IL-35水平與疾病早期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 COVID-19患者不同時(shí)期血漿細(xì)胞因子IL-35和IL-37檢測結(jié)果[M(P25～P75),pg/mL]

2.3IL-35和IL-37水平與臨床結(jié)局的關(guān)系 以患者疾病早期IL-35和IL-37水平的中位數(shù)(53.42、384.66 pg/mL)作為臨界值，將患者分為IL-35/IL-37高水平組和低水平組，分析其對病毒RNA檢測結(jié)果轉(zhuǎn)陰時(shí)間(病毒RNA轉(zhuǎn)陰時(shí)間)和患者住院時(shí)間的影響。結(jié)果顯示，IL-35低水平的患者病毒RNA轉(zhuǎn)陰時(shí)間和住院時(shí)間均短于IL-35高水平組(P<0.05)，而IL-37高水平的患者病毒RNA轉(zhuǎn)陰時(shí)間和住院時(shí)間明顯短于IL-37低水平組(P<0.05)，見表3。

表3 IL-35和IL-37水平與臨床結(jié)局的關(guān)系[M(P25～P75),d]

3 討 論

由SARS-CoV-2感染引起的COVID-19給全球公共衛(wèi)生帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[9]。SARS-CoV-2入侵宿主引發(fā)“過激”的免疫反應(yīng)是其臨床高致死性的主要機(jī)制，主要表現(xiàn)為“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，導(dǎo)致嚴(yán)重的急性肺損傷、ARDS，甚至多器官功能衰竭。臨床研究證實(shí)，COVID-19患者血清中細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)水平與疾病預(yù)后密切相關(guān)[10]。因此，促炎癥因子和抗炎癥因子網(wǎng)絡(luò)的平衡狀態(tài)可能與疾病預(yù)后密切相關(guān)。

本課題組分析了COVID-19患者血漿標(biāo)本中IL-35和IL-37的水平。結(jié)果顯示，患者IL-35水平較健康者降低，但在病程中無明顯變化。IL-35低水平的患者病毒RNA陰性轉(zhuǎn)化時(shí)間和住院時(shí)間更短。有研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病、慢性乙型肝炎患者的血漿IL-35水平低于健康者[11-12]。IL-35雖然是IL-12細(xì)胞因子家族的成員，在結(jié)構(gòu)和組成上有許多相似之處，但在功能上有很大不同。IL-35作為新型調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，其通過IL-12RB2、GP130信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，與受體結(jié)合后導(dǎo)致EBI3和IL-12A靶基因的表達(dá)，EBI3可抑制T細(xì)胞的增殖和輔助性T(Th)17細(xì)胞的發(fā)育和分化，而IL-12A作為活化T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的生長因子，刺激IFN-γ的產(chǎn)生[13-14]。本研究中患者血液中LYMPH減少，導(dǎo)致分泌IL-35的調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞或B細(xì)胞數(shù)量減少，可能是IL-35水平降低的原因之一，表明IL-35的水平可能受到免疫微環(huán)境的影響。

感染早期患者出現(xiàn)IL-37水平反應(yīng)性升高，與相關(guān)研究結(jié)果一致[9]。IL-37水平反應(yīng)性升高可能有利于拮抗“炎癥風(fēng)暴”，維持細(xì)胞因子的平衡狀態(tài)，從而維持宿主免疫系統(tǒng)和重要器官的功能。經(jīng)過臨床治療，患者進(jìn)入恢復(fù)期后，出現(xiàn)了IL-37水平反應(yīng)性降低的現(xiàn)象，表明體內(nèi)炎癥反應(yīng)狀態(tài)趨于穩(wěn)定。本研究結(jié)果中，IL-37高水平組患者的病毒RNA轉(zhuǎn)陰時(shí)間和住院時(shí)間明顯縮短，提示IL-37反應(yīng)性升高可能抑制病毒復(fù)制，從而縮短了患者的住院時(shí)間。表明IL-37可能在SARS-CoV-2感染期間發(fā)揮保護(hù)作用，機(jī)體會隨炎癥反應(yīng)水平動(dòng)態(tài)調(diào)整抗炎反應(yīng)水平。IL-37高水平組有更好的臨床轉(zhuǎn)歸或預(yù)后。高水平IL-37能夠防止病情向重癥發(fā)展，這可能是收治患者住院期間并未出現(xiàn)病情惡化的原因之一。相反，感染早期如未能啟動(dòng)抗炎反應(yīng)可能會出現(xiàn)不良的臨床預(yù)后。

細(xì)胞因子發(fā)揮功能是個(gè)復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體(TLRs)是一種跨膜蛋白模式識別受體，其胞內(nèi)區(qū)含有TLRs和IL-1受體家族特有的結(jié)構(gòu)域TIR。TLR3識別進(jìn)入體內(nèi)的病毒雙鏈RNA，并通過誘導(dǎo)一系列反應(yīng)來保護(hù)宿主免受病毒感染，如Ⅰ型干擾素和細(xì)胞因子的產(chǎn)生、繼發(fā)性NK細(xì)胞反應(yīng)以及最終的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)和抗體產(chǎn)生[10,15]。IL-37通過SMAD3信號通路的調(diào)節(jié)，抑制或減少IL-1A、IL-1RN、IL-6和CCL12等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制樹突細(xì)胞活化，從而抑制過度炎癥所涉及的先天炎癥和免疫反應(yīng)。IL-37可能是IL-18受體(IL-18R1/IL-1Rrp)的配體，還與IL-18結(jié)合蛋白(IL-18BP)結(jié)合，并通過它抑制IL-18的活性，作為早期Th1細(xì)胞因子反應(yīng)的抑制劑[16]。

本課題組初步探討了COVID-19患者疾病過程中IL-35和IL-37的反應(yīng)性。IL-35作為調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子在免疫和感染性疾病中發(fā)揮重要作用，未來有望作為免疫調(diào)節(jié)治療的新靶點(diǎn)，可根據(jù)疾病中IL-35水平進(jìn)行治療或阻斷。IL-37作為重要的抗炎因子，對“細(xì)胞因子炎癥風(fēng)暴”的治療至關(guān)重要，可成為臨床轉(zhuǎn)歸的判斷指標(biāo)之一，可以為下一步的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡偏移的機(jī)制研究和免疫治療提供參考依據(jù)。