王嬋娟，郝志敏，張偉蘭，熊三軍，郭美祥

上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，上海 201400

進(jìn)行性核上性麻痹(PSP)是一種神經(jīng)退行性疾病，核心臨床癥狀為眼肌麻痹、姿勢(shì)不穩(wěn)、運(yùn)動(dòng)減少、認(rèn)知功能障礙，病理學(xué)檢查可見Tau蛋白異常磷酸化[1-4]。PSP發(fā)病較為隱匿，患者在疾病早期往往缺乏典型癥狀，部分患者臨床表現(xiàn)與原發(fā)性帕金森病、帕金森綜合征相似[5]，且無特異的實(shí)驗(yàn)室檢查，這為PSP的早期臨床診斷帶來了不便，因此找到一種或多種可提示PSP發(fā)生和發(fā)展的生物標(biāo)志物，對(duì)于PSP的早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)具有重要意義。在治療方面，由于PSP的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，故目前沒有特異性治療藥物，臨床上僅應(yīng)用左旋多巴和安坦等緩解癥狀[6-9]。尋找PSP的潛在發(fā)病機(jī)制，是開發(fā)治療藥物的關(guān)鍵，亦是當(dāng)前PSP研究的重點(diǎn)[10]。生物信息學(xué)是一門新興的生命科學(xué)與計(jì)算科學(xué)的前沿交叉學(xué)科，其通過對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行二次分析，可幫助人們更加深刻地認(rèn)識(shí)疾病的本質(zhì)，更加高效地尋找疾病潛在治療靶點(diǎn)。為此，本研究擬利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫2R(GEO2R)中的數(shù)據(jù)，對(duì)在PSP中差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行分析，探索PSP潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料 通過在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中查詢PSP患者基因表達(dá)芯片，確定了GSE6613芯片數(shù)據(jù)集(共包含105張芯片的數(shù)據(jù))為研究目標(biāo)，其中健康者芯片23張，PSP患者芯片6張，帕金森病患者芯片77張。本研究僅分析PSP患者(PSP組，n=6)和健康者(健康對(duì)照組，n=23)的數(shù)據(jù)。該芯片數(shù)據(jù)集的建立依托于GPL96平臺(tái)，本課題組在Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫中下載了該數(shù)據(jù)集的全部矩陣文件，此矩陣文件中包含了所有標(biāo)本全部被檢測(cè)基因的表達(dá)水平。

1.2方法

1.2.1DEGs篩選 GEO2R平臺(tái)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo/GEO2R)是GEO數(shù)據(jù)庫中以R語言為基礎(chǔ)的交互式分析工具[11]。本研究利用GEO2R平臺(tái)對(duì)PSP患者及健康人群全血細(xì)胞的DEGs進(jìn)行篩選。以基因倍數(shù)改變(FC)取對(duì)數(shù)值(log2FC)>1.5作為上調(diào)DEGs的篩選標(biāo)準(zhǔn)；以log2FC<-1.5作為下調(diào)DEGs的篩選標(biāo)準(zhǔn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。下載該芯片所有被檢測(cè)基因原始表達(dá)水平數(shù)據(jù)。

1.2.2基因本體論(GO) GO富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號(hào)通路分析能夠注釋一組基因的多項(xiàng)功能，包括分子功能(MF)、細(xì)胞組分(CC)和生物學(xué)過程(BP)。KEGG本質(zhì)上是一種獲取基因生物學(xué)功能甚至高級(jí)基因組信息的資源，KEGG信號(hào)通路分析能夠提示某些疾病相關(guān)基因及藥物的生物學(xué)通路。本研究通過DAVID(http://david.ncifcrf.gov,6.7版)進(jìn)行了該芯片的GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)能夠識(shí)別健康個(gè)體與患者之間的核心DEGs和關(guān)鍵基因模塊。首先將本芯片中全部的DEGs導(dǎo)入STRING在線分析軟件(http://www.stringdb.org/)，預(yù)測(cè)這些基因所編碼蛋白之間的相互作用；隨后,在STRING分析的基礎(chǔ)上，采用Cytoscape軟件平臺(tái)構(gòu)建基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)這些基因的連接度排序,篩選出連接度最高的基因。

1.2.4臨床標(biāo)本分組 選取本院2016年1月至2021年12月留存的9例PSP患者外周血標(biāo)本作為試驗(yàn)組，其中男6例、女3例，年齡為(70.78±5.95)歲；另外從2022年1—2月健康查體人群中，隨機(jī)選取61～81歲的男性血標(biāo)本6例、女性血標(biāo)本3例，作為對(duì)照組，年齡(72.11±8.02)歲。兩組研究對(duì)象在抽血前均已簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)試驗(yàn)組患者符合《中國進(jìn)行性核上性麻痹臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)》[4]；(2)對(duì)照組人群無神經(jīng)系統(tǒng)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在腦血管疾病；(2)患有惡性腫瘤；(3)患者或家屬拒絕保存血液標(biāo)本。

1.2.5相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) 應(yīng)用RNA提取試劑盒提取血液標(biāo)本中的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)相關(guān)DEGs及PPI網(wǎng)絡(luò)中連接度最高的KRAS基因的相對(duì)表達(dá)水平，各引物序列見表1。每個(gè)標(biāo)本設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。擴(kuò)增基因采取兩步法：95 ℃、15 min預(yù)變性；95 ℃、10 s，60 ℃、32 s進(jìn)行38循環(huán)。應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)長度。選取GAPDH作為內(nèi)參基因，上游：CTGGGCTACACTGAGCACC，下游：AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG。

表1 各基因引物序列

續(xù)表1 各基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1DEGs的篩選結(jié)果 共篩選出DEGs 98個(gè)，上調(diào)基因54個(gè)，下調(diào)基因44個(gè)。在98個(gè)DEGs中，差異最大的5個(gè)上調(diào)基因分別為MYOM2、EMP1、DKK2、FBN1、POLA2；差異最大的5個(gè)下調(diào)基因分別為IVD、TMED7、MSMO1、CASP3和DLG1。見表2。

表2 DEGs的基本生物學(xué)功能

2.2GO富集分析 分析本芯片中所有的DEGs，發(fā)現(xiàn)上調(diào)DEGs的MF包括轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核酸結(jié)合、金屬離子結(jié)合，而下調(diào)DEGs的MF主要包括蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合、微管結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合。

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心基因的篩選 通過構(gòu)建PPI，篩選出連接度最高的基因——KRAS，以及與其相關(guān)的7個(gè)基因：MSH6、LOX、CASP3、AKTIP、KRT20、RECK和PBRM1。見表3。

表3 DEGs的KEGG富集分析

2.5臨床標(biāo)本各基因表達(dá)差異 與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組EMP1和DKK2基因表達(dá)上調(diào)，DLG1和KRAS基因表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 臨床標(biāo)本各基因表達(dá)差異比較

組別IVDTMED7MSMO1CASP3DLG1KRAS對(duì)照組0.93±0.110.94±0.120.98±0.121.00±0.100.94±0.830.99±0.11試驗(yàn)組0.95±0.090.90±0.090.91±0.110.96±0.080.80±0.170.69±0.09t0.2440.881.2380.8322.2555.912P0.8110.3910.2330.4170.038<0.001

3 討 論

PSP是一種較為少見的神經(jīng)變性疾病，以眼球運(yùn)動(dòng)障礙、姿勢(shì)不穩(wěn)、運(yùn)動(dòng)障礙以及認(rèn)知功能障礙為核心臨床特征[1-2]，我國尚無確切的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，日本的一項(xiàng)研究顯示，PSP總體患病率約為18/10萬[5]，PSP的主要病變部位在中腦、蒼白球、丘腦底核、橋腦被蓋、小腦齒狀核和小腦上腳等。目前關(guān)于PSP的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，且缺乏特異性的輔助檢查手段，臨床上診斷和鑒別困難，較易誤診為其他神經(jīng)退行性疾病。

本研究通過對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫中的PSP患者及健康人群全血細(xì)胞的DEGs進(jìn)行篩查，共發(fā)現(xiàn)98個(gè)DEGs。利用臨床血液標(biāo)本，進(jìn)一步對(duì)差異最大的5個(gè)上調(diào)基和差異最大的5個(gè)下調(diào)基因進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，EMP1和DKK2基因表達(dá)上調(diào)，DLG1基因表達(dá)下調(diào)。其中EMP1編碼一種上皮膜蛋白，編碼蛋白位于質(zhì)膜上，其主要參與濾泡聚集和細(xì)胞死亡[11]。DKK2可通過抑制LRP5/6與WNT的相互作用，促進(jìn)LRP5/6內(nèi)化的跨膜蛋白KREMEN形成三元復(fù)合物，拮抗典型WNT信號(hào)。在成年人中，DKK與骨形成、骨病、癌癥和阿爾茨海默病有關(guān)[12]。DLG1編碼一種正常發(fā)育所需的基本多結(jié)構(gòu)域支架蛋白，可在黏附、連接、組裝，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、突觸形成和淋巴細(xì)胞活化中發(fā)揮作用[13]。這與生物信息學(xué)分析結(jié)果不完全一致，可能是由于公共數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)來源于白種人和黑種人，而臨床驗(yàn)證的基因數(shù)據(jù)來源于黃種人，基因表達(dá)在不同種族之間存在差異，同時(shí)標(biāo)本量過小也可引起結(jié)果的不一致。但是EMP1、DKK2和DLG1基因在兩部分實(shí)驗(yàn)中表達(dá)趨勢(shì)是一致的，且在PSP的既往研究中鮮有報(bào)道，這為PSP的生物標(biāo)志物篩選提供了參考。同時(shí)，本課題組還根據(jù)這些DEGs的相互作用關(guān)系構(gòu)建了PPI，發(fā)現(xiàn)KRAS基因的連接度最高，臨床標(biāo)本驗(yàn)證亦可發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平降低。KRAS基因是哺乳動(dòng)物RAS基因家族的Kirsten-RAS基因同源物，編碼一種屬于鳥苷三磷酸酶(GTPase)超家族的蛋白質(zhì)，其可通過將效應(yīng)分子直接與GTP結(jié)合來激活多條信號(hào)通路[14]。與其相關(guān)的7個(gè)基因中，MSH6基因編碼DNA錯(cuò)配修復(fù)MutS家族中的一個(gè)成員，其可在修復(fù)錯(cuò)配核苷酸之前識(shí)別錯(cuò)配核苷酸[15]；LOX基因編碼賴氨酰氧化酶家族的一員，這種酶的銅依賴性胺氧化酶活性在膠原和彈性蛋白的交聯(lián)中起作用[16]；CASP3基因編碼的蛋白質(zhì)是一種半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起著核心作用，與阿爾茨海默病中的神經(jīng)元死亡有關(guān)[17]；AKTIP基因編碼蛋白直接與絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白激酶B相互作用，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用[18]；KRT20基因編碼的蛋白質(zhì)是角蛋白家族的一員，調(diào)控上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性[19]；RECK基因編碼的蛋白質(zhì)是一種富含半胱氨酸的細(xì)胞外蛋白，具有蛋白酶抑制劑樣結(jié)構(gòu)域，在正常細(xì)胞中作為基質(zhì)金屬蛋白酶-9的負(fù)調(diào)節(jié)因子，基質(zhì)金屬蛋白酶-9是參與凋亡、腫瘤侵襲等生物學(xué)進(jìn)程的關(guān)鍵酶[20]；PBRM1基因編碼ATP依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合物的一個(gè)亞單位，該蛋白是核激素受體配體依賴性轉(zhuǎn)錄激活所必需的復(fù)合物的組成部分[21]?？梢姾诵幕騅RAS主要調(diào)控遺傳物質(zhì)的復(fù)制與細(xì)胞凋亡相關(guān)生物學(xué)進(jìn)程，是PSP的可能發(fā)病機(jī)制和潛在治療靶點(diǎn)之一。

綜上所述，本研究基于生物信息學(xué)首次對(duì)PSP和健康體檢人群全血細(xì)胞表達(dá)差異基因進(jìn)行分析，從生物信息學(xué)角度提出炎癥、免疫紊亂、代謝紊亂等與PSP的發(fā)病密切相關(guān)。結(jié)合臨床標(biāo)本驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，EMP1、DKK2和DLG1基因差異表達(dá)顯著，將這些標(biāo)志物結(jié)合臨床，有望提高PSP診斷準(zhǔn)確率。同時(shí)，依據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)，挑選出了有望成為PSP治療靶點(diǎn)的KRAS基因，為PSP的進(jìn)一步研究提供了參考。