周世潔，王 莉，劉良明，李 濤，閆 紅

400042 重慶，陸軍特色醫(yī)學中心：麻醉科1，戰(zhàn)傷休克與輸血研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室2

膿毒癥是宿主對感染反應失調而導致的危及生命的器官功能障礙。長時間以來，腸道被認為在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關重要的作用，是引起多器官功能障礙綜合征的助推器。膿毒癥時產生的前炎癥細胞因子，包括TNF-α、IL-1β等會引起腸絨毛損傷萎縮、腸上皮細胞凋亡，導致腸道屏障功能破壞、通透性增加，腸道細菌及其釋放的內毒素進入血液循環(huán)，引起腸源性感染，對膿毒癥患者造成致命打擊。因此研究膿毒癥腸道屏障功能保護措施對提高膿毒癥患者救治率有重要意義。

右美托咪定是一種高效、高選擇性的α2腎上腺素能受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜良好、易喚醒、不引起明顯呼吸抑制、顯著減少患者術后譫妄等作用，目前廣泛應用于重癥和圍術期患者。近年來研究報道右美托咪定對膿毒癥引起的器官功能損傷具有保護作用,但右美托咪定對膿毒癥腸道屏障功能是否具有保護作用，目前尚不清楚。對此，本研究采用大鼠盲腸結扎穿孔術(cecal ligation and puncture，CLP)構建膿毒癥模型和LPS處理的細胞(RAW264.7)模型，觀察右美托咪定對膿毒癥大鼠腸道通透性、前炎癥細胞因子、腸道病理結構、巨噬細胞極化等的影響，探究其對膿毒癥大鼠腸道屏障功能的保護作用及機制，為膿毒癥治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

成年雄性SPF級SD大鼠，體質量(200±20)g，由陸軍特色醫(yī)學中心實驗動物中心提供。鹽酸右美托咪定注射液購自中國揚子江藥業(yè)集團有限公司；伊文思藍(Evans blue, EB)、iNOS抗體購自美國Sigma公司；二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)、腫瘤壞死因子-ɑ(tumour necrosis factor ɑ，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒購自Elabsicence公司；2,6-二異丙基苯胺(2,6-diisopropylaniline,DAPI)購自美國Aabcam公司。

1.2 大鼠膿毒癥模型制備

大鼠術前12 h禁食，自由飲水。根據本實驗室前期報道的方法，用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔麻醉，制作膿毒癥模型。膿毒癥模型術后12 h，觀察大鼠平均動脈壓(mean arterial blood pressure, MAP)，MAP下降30%及以上，認為模型制備成功。

1.3 實驗方案

1.3.1 實驗設計與分組 128只SD大鼠按照隨機數字表法分為4組，每組32只大鼠。假手術(Sham)組：僅開腹關腹，不做盲腸結扎穿孔術；膿毒癥組(sepsis, Sep組)：采用盲腸結扎穿孔術建立膿毒癥模型；常規(guī)治療組(conventional treatment, Ct組)：在膿毒癥組建模術后12 h，經股靜脈插管輸注林格氏液(35 mL/kg)+血管活性藥物多巴胺(1.75 mg/kg)，輸注速度為2.5 mL/h，同時肌注抗生素頭孢呋辛納(100 mg/kg)；右美托咪定組(Dex組)：在盲腸結扎穿孔術前30 min，經尾靜脈注射右美托咪定(10 μg/kg)，術后12 h，在常規(guī)治療基礎上經股靜脈輸注右美托咪定(10 μg/kg)。實驗分為3批：第1批(每組16只)用于觀察SD大鼠24 h存活時間和存活率；第2批(每組8只)在復蘇完成后用于檢測SD大鼠腸道通透性和小腸病理變化；第3批(每組8只)在復蘇結束后用于檢測血漿中前炎癥細胞因子水平和腸道巨噬細胞極化情況。

1.3.2 RAW264.7細胞模型構建 將RAW264.7巨噬細胞分為3組，正常對照(Control)組：PBS清洗培養(yǎng)皿后，更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)組：PBS清洗培養(yǎng)皿后，更換為無血清培養(yǎng)基，并加入500 ng/mL LPS處理12 h；Dex組：PBS清洗培養(yǎng)皿后，替換為無血清培養(yǎng)基，然后給予1 μmol/L右美托咪定，待30 min后,再加入500 ng/mL LPS處理12 h。實驗前1 d將RAW264.7細胞接種于培養(yǎng)皿內，每個培養(yǎng)皿細胞數為1×10/mL。取細胞上清液用于測定細胞上清液中前炎癥細胞因子(TNF-α)水平。

1.4 檢測指標

1.4.1 存活時間和存活率 膿毒癥大鼠復蘇完成后，拔出股靜脈插管同時結扎血管，并逐層縫合傷口。然后將大鼠放回籠中正常飼養(yǎng)，自由進食飲水，每30 min觀察1次，直至復蘇后24 h，記錄大鼠的存活時間和存活率。

1.4.2 腸道通透性 為觀察右美托咪定對膿毒癥大鼠腸屏障功能的保護作用，分別采用EB灌注腸腔測定腸組織的通透性和取靜脈血檢測DAO含量，觀察腸道通透性。膿毒癥大鼠復蘇完成后，取靜脈血1 mL，室溫下靜置30 min，3 500 r/min 離心10 min，取上層血清，ELISA試劑盒檢測血中DAO含量。另取一段長約7 cm的小腸，用PBS沖洗干凈腸腔并制備成腸囊，注入0.2 mL 1.5% 的EB溶液，37 ℃水浴30 min，打開腸囊，PBS沖洗至沖洗液澄清后50 ℃干燥24 h，記錄腸干質量，加入甲酰胺溶液于50 ℃孵育24 h，用酶標儀檢測上清，讀取波長650 nm處的光密度值，根據

D

(650)值計算腸組織中EB含量。

1.4.3 腸組織病理結構 膿毒癥大鼠復蘇完成后，將其麻醉固定，開腹，取一段腸組織用PBS沖洗干凈后，置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色，用光學顯微鏡觀察腸組織病理結構情況。

1.4.4 血清前炎癥細胞因子 復蘇完成后，經靜脈取血2 mL，室溫下靜置30 min，3 500 r/min 離心10 min，取上層血清，采用ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量。

1.4.5 免疫熒光觀察腸道巨噬細胞iNOS表達 復蘇完成后，將大鼠麻醉固定開腹，取一段腸組織，用冰PBS沖洗腸腔，放入4%多聚甲醛中固定24 h，20%蔗糖脫水24 h后，換用30%蔗糖脫水24 h，待樣本沉底后，用OCT包埋，做冰凍切片(切片厚度為20 μm)。PBS洗滌3次，每次5 min，3%過氧化氫處理10 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加羊血清室溫下封閉30 min，吸去多余液體，滴加稀釋的一抗(iNOS，1∶200)，4 ℃過夜，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加與一抗相對于的熒光二抗，室溫下避光孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min，DAPI(1∶50)37 ℃避光反應10 min，PBS洗滌3次，每次5 min。在Leica激光共聚焦顯微鏡下觀察iNOS的表達。

1.4.6 免疫熒光觀察離體巨噬細胞iNOS表達 將RAW264.7細胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿，待細胞生長良好后，棄培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加羊血清室溫下封閉30 min，吸去多余液體，滴加稀釋的一抗(iNOS，1∶200)，4 ℃過夜，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加與一抗相對于的熒光二抗，室溫下避光孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min，DAPI(1∶50)37 ℃避光反應10 min，PBS洗滌3次，每次5 min。在Leica激光共聚焦顯微鏡下觀察iNOS的表達。

1.4.7 細胞上清前炎癥細胞因子水平檢測 收集各組細胞上清液，依據ELISA試劑盒方法檢測細胞上清液中TNF-α含量。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行分析，數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析，存活時間和存活率用Kaplan-Meier法分析。

P

<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 右美托咪定對膿毒癥大鼠存活時間和存活率的影響

膿毒癥組大鼠24 h存活1只，存活率為6.25%，存活時間為(5.70±6.36)h；常規(guī)液體治療組大鼠24 h存活2只，存活率為12.50%，存活時間為(10.10±7.80)h，與膿毒癥組相比，存活時間有所增加；右美托咪定治療組大鼠24 h存活6只，存活率為37.50%，存活時間為(18.30±5.80)h,存活率較常規(guī)治療組顯著提高，存活時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05，圖1)。

a:P<0.01，與Sham組比較；b:P<0.05，與Ct組比較; c:P<0.01，與Sep組比較

2.2 右美托咪定對膿毒癥大鼠腸道通透性的影響

EB灌注腸腔結果發(fā)現：膿毒癥后大鼠腸組織滲漏明顯，與假手術組相比差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.01)；常規(guī)液體治療后，腸道屏障功能有部分改善；經右美托咪定治療后，膿毒癥大鼠腸屏障功能明顯改善，與常規(guī)治療組相比，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.01，圖2A)。假手術組大鼠血中DAO含量為(0.34±0.04)ng/mL，與假手術組比較，膿毒癥組大鼠血中DAO含量明顯增加，為(6.32±0.83)ng/mL，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.01)；常規(guī)治療組大鼠血中DAO含量為(5.89±1.01)ng/mL，與膿毒癥組相比差異無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)；右美托咪定可明顯降低血中DAO含量，其值為(4.47±0.81)ng/mL，與常規(guī)治療組比較差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)(圖2B)。

a:P<0.01，與Sham組比較；b:P<0.05，與Ct組比較； c:P<0.01，與Sep組比較

2.3 右美托咪定對膿毒癥大鼠腸組織結構的影響

腸組織HE染色結果顯示：假手術組大鼠腸絨毛結構完整清晰,柱狀上皮細胞排列整齊，未見紅細胞及炎性細胞浸潤；膿毒癥組腸絨毛萎縮、斷裂，紅細胞和炎性細胞浸潤明顯；常規(guī)治療組未見明顯改善；右美托咪定治療后，腸絨毛萎縮情況明顯好轉，腸絨毛排列整齊，紅細胞及炎性細胞浸潤減少，腸組織結構顯著恢復，提示右美托咪定改善了膿毒癥大鼠腸病理損傷(圖3)。

A: Sham組；B：Sep組；C：Ct組；D：Dex組

2.4 右美托咪定對膿毒癥大鼠血前炎癥細胞因子水平的影響

與假手術組相比，膿毒癥組大鼠血清前炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.01)；常規(guī)治療組大鼠血清前炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β有一定程度下降，與膿毒癥組相比，降低比例為10.56%，無顯著性差異(

P

>0.05)；右美托咪定治療后，大鼠血清前炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β下降明顯，與膿毒癥組比較，降低比例為33.93%，與常規(guī)治療組相比，降低比例為26.13%(

P

<0.01)，見圖4。

a: P<0.01，與Sham組比較；b: P<0.01,與Ct組比較； c： P<0.01，與Sep組比較

2.5 右美托咪定對M1型巨噬細胞的影響

腸道巨噬細胞極化類型的免疫熒光染色結果提示：Dex能抑制巨噬細胞向M1型極化(圖5)。膿毒癥組大鼠腸道巨噬細胞iNOS表達增加，提示膿毒癥后腸道巨噬細胞M1型的數量增多；與膿毒癥組相比，常規(guī)治療組大鼠腸道巨噬細胞iNOS表達未見明顯減少；右美托咪定組大鼠腸道巨噬細胞iNOS表達則明顯減少，提示M1型巨噬細胞數量減少。RAW264.7細胞實驗結果顯示：LPS刺激后，RAW264.7細胞iNOS明顯增多、TNF-α分泌顯著增加(

P

<0.01)，經右美托咪定處理后，RAW264.7細胞iNOS表達和TNF-α水平均明顯降低(

P

<0.05)，見圖6、7。說明右美托咪定可抑制巨噬細胞M1表型， 抑制前炎癥細胞因子釋放。

圖5 免疫熒光觀察腸道巨噬細胞iNOS的表達

圖6 免疫熒光觀察離體巨噬細胞iNOS的表達

a:P<0.01，與Control組比較；b:P<0.05,與LPS組比較

3 討論

膿毒癥表現為機體對感染的免疫反應失調，具有很高的發(fā)病率和死亡率，是重癥監(jiān)護病房住院患者死亡常見原因之一，腸道屏障功能受損在膿毒癥病程發(fā)展中具有重要作用。膿毒癥后腸道通透性明顯增加，腸道內有毒物質進入血液循環(huán)，進一步加重膿毒癥病情的發(fā)展。

右美托咪定是臨床常用的麻醉鎮(zhèn)靜藥物，近年來越來越多的研究表明右美托咪定對器官功能具有保護作用。SHE等發(fā)現右美托咪定對膿毒癥大鼠血管內皮屏障具有保護作用，其機制與保護線粒體功能有關。ZHANG等發(fā)現右美托咪定能增加腸上皮細胞間緊密連接蛋白的表達并減少細胞凋亡，改善腸道損傷。右美托咪定對膿毒癥器官功能的保護作用與它能抑制炎癥有關，MEI等證實Dex可顯著抑制膿毒癥大鼠炎癥反應而改善腦功能。本研究發(fā)現：膿毒癥大鼠血清前炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β明顯增加，而右美托咪定可顯著降低上述炎癥細胞因子水平，改善腸道屏障功能，提高膿毒癥大鼠的存活率和存活時間。但右美托咪定是如何降低膿毒癥后腸道炎癥反應的呢？

巨噬細胞是一種異質性極強的免疫細胞，不同病理刺激條件下巨噬細胞會極化為不同的類型，在機體炎癥反應中發(fā)揮重要作用。巨噬細胞極化類型主要包括經典激活的巨噬細胞(M1)和交替激活的巨噬細胞(M2)。M1型巨噬細胞主要由脂多糖(LPS)活化，分泌促炎細胞因子(TNF-α、IL-1β)，在膿毒癥過度炎癥期激發(fā)機體免疫應答，引起免疫功能紊亂；M2型巨噬細胞則主要由IL-4、干擾素γ(interferon-γ, IFN-γ)激活，釋放抗炎因子IL-10等限制炎癥，促進組織修復以及受傷區(qū)域的愈合。本研究選取腸道巨噬細胞作為研究對象，探究Dex對M1型巨噬細胞極化的影響。整體實驗結果發(fā)現Dex能顯著降低促炎因子TNF-α、IL-β釋放，抑制腸道巨噬細胞的M1極化，M1型標志物iNOS，TNF-α表達減少。細胞實驗發(fā)現Dex能抑制RAW264.7細胞向M1型極化、降低炎癥細胞因子的水平。研究結果提示，Dex在膿毒癥中發(fā)揮的抑炎效應，可能與其抑制巨噬細胞向M1極化相關。

綜上所述，本研究發(fā)現右美托咪定對膿毒癥引起的腸道屏障功能損傷具有保護作用，其機制可能與右美托咪定抑制腸道巨噬細胞向M1型極化，降低炎癥反應有關。這在一定程度上闡釋了Dex通過抑炎效應發(fā)揮對器官功能保護作用的機制，為膿毒癥的器官功能保護提供防治措施。但Dex是否會促進腸道巨噬細胞向M2型極化，以及Dex如何調控巨噬細胞極性的機制，還有待進一步研究。