蔡美玲，李登紅，農(nóng)麗松，黃光強(qiáng)，王洪濤

巴迪泰（廣西）生物科技有限公司 （廣西南寧 530031）

20 世紀(jì)60 年代初發(fā)明的標(biāo)記免疫分析法，是一種將多種生物標(biāo)記、示蹤技術(shù)與醫(yī)學(xué)免疫抗原抗體相結(jié)合而產(chǎn)生的新方法，被廣泛應(yīng)用在疾病診斷和療效觀(guān)察領(lǐng)域。目前，標(biāo)記免疫分析法主要包括酶聯(lián)免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，EIA）、放射免疫分析法（radio immunoassay，RIA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）、電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（electrical chemiluminescent immunoassay，ECLIA）、時(shí)間分辨熒光免疫分析法（time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）[1-2]。在上述方法中，TRFIA是于20世紀(jì)80年代中期發(fā)明的一種超微量熒光標(biāo)記技術(shù)，其對(duì)試驗(yàn)樣品自然熒光強(qiáng)度的影響較小，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、標(biāo)記物易生產(chǎn)、試劑使用貨架期長(zhǎng)、無(wú)放射性化學(xué)危害、重復(fù)性好、操作方法簡(jiǎn)便、區(qū)分度好和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，成為自放射免疫分析之后所實(shí)現(xiàn)的又一次嶄新的技術(shù)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，并且靈敏度也大大地超過(guò)了放射性同位素的最高極限（表1），是一種極具潛力的超微量檢測(cè)手段。這種靈敏度高、準(zhǔn)確性好、性能穩(wěn)定的超微量分析法，不管是對(duì)食品中有毒有害物質(zhì)的檢測(cè)，還是對(duì)環(huán)境中的痕量氣體有毒元素的測(cè)定，又或是對(duì)生物體內(nèi)各種功能抑制因子的定性分析，甚至是對(duì)人類(lèi)自身疾病的診斷都具有重大意義[3]。

表1 標(biāo)記免疫分析法的檢測(cè)靈敏度

1 TRFIA 的原理及優(yōu)勢(shì)

TRFIA 的原理是以三價(jià)鑭系元素離子或其螯合物為標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記抗體、抗原或其他各種具有生物活性的靶細(xì)胞，待反應(yīng)體系（抗原抗體反應(yīng)、生物素-親和素反應(yīng)等）發(fā)生后，用TRFIA 分析檢測(cè)器測(cè)定產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，與對(duì)照熒光強(qiáng)度進(jìn)行對(duì)比來(lái)推算出反應(yīng)體系中待測(cè)物的濃度[4-5]。

與傳統(tǒng)的免疫分析法比較，TRFIA 的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在以三價(jià)鑭系元素離子或其螯合物為標(biāo)記物所具有的獨(dú)特理化特性，具體優(yōu)勢(shì)如下：（1）鑭系元素或其螯合物的熒光壽命長(zhǎng)，是其他熒光團(tuán)的103～106倍（表2），能降低試驗(yàn)樣品或試劑本身的熒光壽命，提高靈敏度；（2）激發(fā)光和發(fā)射光的Stokes 位移大于200 nm（普通熒光Stokes 位移28 nm） （表3），能夠消除激發(fā)光和發(fā)射光的干擾；（3）鑭系元素或其螯合物熒光強(qiáng)度比值的特異性高，能有效降低各種來(lái)自不同背景光的干擾；（4）鑭系元素離子標(biāo)記物體積小，既保證了被檢測(cè)物質(zhì)的穩(wěn)定性，又能實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)標(biāo)記；標(biāo)記物穩(wěn)定，能夠?qū)?biāo)記物進(jìn)行多次激發(fā)，將熒光信號(hào)累加后取平均值的方法，大大提高了準(zhǔn)確性；（5）鑭系元素離子標(biāo)記物能夠有效保存1～2年，克服了其他免疫分析方法不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。

表2 常見(jiàn)熒光團(tuán)的熒光壽命

表3 鑭系元素螯合物激發(fā)光波長(zhǎng)、發(fā)射光波長(zhǎng)和Stokes 位移

2 TRFIA 的反應(yīng)模式

目前，TRFIA 的反應(yīng)模式目前應(yīng)用最廣泛的是夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法[6-7]。夾心法大多數(shù)用于測(cè)定樣品中的各種蛋白與大分子物質(zhì)，而競(jìng)爭(zhēng)法則大多用于檢測(cè)與抗體結(jié)合的各種小分子物質(zhì)及半抗原。反應(yīng)模式流程如圖1、圖2所示。

圖1 夾心法反應(yīng)流程

圖2 競(jìng)爭(zhēng)法反應(yīng)流程

3 TRFIA 的研究進(jìn)展

3.1 酶放大的TRFIA

1992年發(fā)明的酶放大的TRFIA 是以5-氟水楊酸磷酸酯（5-fluorosalicylate phosphate，F(xiàn)SA）作為底物，用堿性磷酸酶分子對(duì)其催化，與Tb3+相互反應(yīng)生成三元熒光絡(luò)合物（FSA-Tb3+-EDTA），在紫外光的激發(fā)條件下，即使不加增強(qiáng)液，在時(shí)間分辨熒光儀上也能夠檢測(cè)出熒光絡(luò)合物Tb3+的熒光信號(hào)[8]。趙啟仁[9]等使用酶放大的TRFIA 對(duì)核酸擴(kuò)增以及磷酸酶的熒光進(jìn)行測(cè)定，靈敏度超過(guò)10 pg 。

3.2 雙標(biāo)記及多標(biāo)記的TRFIA

在目前的熒光標(biāo)記分析法中，雙標(biāo)記及多標(biāo)記的TRFIA 仍然是獨(dú)一無(wú)二的，它充分利用鑭系離子之間不同的熒光波長(zhǎng)和最大的熒光離子衰變持續(xù)時(shí)間的巨大差別，引入了兩種或兩種以上的鑭系離子標(biāo)記物，因此它們可以同時(shí)檢測(cè)出同一樣品中的不同化合物。常用于雙標(biāo)記的鑭系離子有Sm3+和Eu33+、Eu3+和Tb3+[10]。Xu 等[11]提出的熒光離子增強(qiáng)液分別實(shí)現(xiàn)了以上兩種雙重標(biāo)記，同時(shí)靈敏度也不受影響。多標(biāo)記測(cè)定分析技術(shù)具有省時(shí)、節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本兩大特點(diǎn)，可廣泛用于多種珍貴分子的生物篩查檢測(cè)實(shí)驗(yàn)[12-13]。

3.3 鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)的TRFIA

鏈霉親和素（streptavidin，SA）不帶糖基、等電點(diǎn)低，并且在待測(cè)物的檢測(cè)過(guò)程中的背景遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于親和素（avidin，AV），最大限度地提高了靈敏度[14]。由于SA-biotin 熒光系統(tǒng)同時(shí)可與抗原、抗體、報(bào)告酶等待測(cè)物質(zhì)反應(yīng)，使其在生物檢測(cè)系統(tǒng)中使用廣泛。1998年建立的SA-biotin 系統(tǒng)的TRFIA 技術(shù)測(cè)定人體血液中玻尿酸的含量，最低檢出限小于0.24 mg/L，并且在科研以及醫(yī)療行業(yè)，常用血液中的玻尿酸的濃度作比對(duì)。

3.4 固相的TRFIA

為了克服解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觯╠issociation enhanced lauthanide fluoroimmunoassay，DELFIA）的缺點(diǎn)，而建立的固相的TRFIA，它以4，7-二氯磺基苯-1，10二氮雜菲-2，9 二羧酸（4，7-bis-chorosulfophenyl-1，10-phenanthroline-2，9-dicarboxylic acid，BCPDA） 為螯合劑，連接Eu3+和多種蛋白質(zhì)，制備一種稀土元素標(biāo)記的免疫分析復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)固相測(cè)定[15]。因?yàn)锽CPDA 分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)部位可與Eu3+相連形成BCPDAEu3+螯合物，此螯合物本身就具有強(qiáng)化熒光的功能，所以無(wú)需額外添加熒光增強(qiáng)液，就可以直接檢測(cè)這種復(fù)合物的熒光特征信號(hào)。目前，利用這種螯合物對(duì)皮質(zhì)醇、腸腺等病毒以及茶堿開(kāi)展了測(cè)試。文獻(xiàn)報(bào)道標(biāo)記的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），也是使用BCPDA 新型雙向功能螯合物，對(duì)固相的TRFIA 技術(shù)進(jìn)行研究，減少背景對(duì)熒光干擾，提高檢測(cè)熒光的靈敏度[16]。

3.5 TRFIA 與激光技術(shù)聯(lián)用

TRFIA 與激光技術(shù)聯(lián)用主要是通過(guò)脈沖激光和其他熒光特性檢測(cè)系統(tǒng)相互結(jié)合而產(chǎn)生的。7-碘-8-羥基喹啉-5-磺酸和8-羥基喹啉-5-磺酸都可以與Al、Zn、Mg、Cd 等各種金屬離子反應(yīng)形成絡(luò)合物。在不同介質(zhì)、不同增敏劑的作用下，熒光絡(luò)合物產(chǎn)生不同的熒光特性。Yu 等[17]在此基礎(chǔ)上，成功建立了一種基于Al、Zn、Mg、Cd 的聯(lián)用激光-TRFIA 測(cè)定方法。另外，將1.5 ml 0.1 mol/L 的檸檬酸鈉加入到pH=6的NaAc-HAc 緩沖體系中，檢測(cè)不到Al3+和Mg2+的熒光強(qiáng)度，而幾乎不影響Zn2+熒光的測(cè)量結(jié)果。

3.6 TRFIA 與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)連用

TRFIA 與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)相結(jié)合，簡(jiǎn)稱(chēng)PCR-TRF，使得檢測(cè)PCR 生成物更為簡(jiǎn)便，廣泛用于與PCR 聯(lián)用的檢測(cè)方法,包括套疊式PCR-TRF、雙標(biāo)記PCR法、PCR-TRFS 直接定量法、時(shí)間分辨熒光掃PCR與TRFIA 聯(lián)用來(lái)檢測(cè)病毒的核酸[18]。研究人員開(kāi)展的PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，是用Eu3+標(biāo)記寡核苷酸引物，不用進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)步驟，就能夠直接檢測(cè)，不僅優(yōu)化了操作方法，還提高了PCR 的靈敏度和特異度。

4 TRFIA 在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

4.1 在病原微生物方面的應(yīng)用

在傳染性疾病的預(yù)防檢測(cè)和治療研究領(lǐng)域中，TRFIA 應(yīng)用越來(lái)越普遍，比如，建立的TRFIA 法測(cè)試甲肝病毒（hepatitis a virus，HAV）、乙肝病毒（hepatitis b virus，HBV）、丙肝病毒、流感病毒等[19]。2005年研制出了以雙抗體夾心法的TRFIA技術(shù)，用該技術(shù)檢測(cè)新型冠狀病毒SARS-CoVN 抗原，結(jié)果顯示靈敏度達(dá)0.02 ng/ml。近年來(lái)國(guó)內(nèi)研究者建立了TRFIA 法對(duì)檢測(cè)限較低的乙肝五項(xiàng)標(biāo)志物進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)乙型肝炎病毒感染的診斷、療效的觀(guān)察及預(yù)后的判斷有較大價(jià)值。

4.2 檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物的水平

通過(guò)TRFIA 測(cè)定人體腫瘤標(biāo)志物的水平來(lái)檢測(cè)癌癥病變[20]，包括甲胎蛋白、癌胚抗原、糖類(lèi)抗原CA125等。CA125是一種腫瘤相關(guān)抗原，許多相關(guān)疾病均可引起其升高，作為一種廣譜的標(biāo)志物，82.2%卵巢癌、58%胰腺癌、32%肺癌及其他非婦科腫瘤皆有不同程度的升高。2005年研制出的CA125時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑盒，在0～2000 U/ml 的范圍內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)HooK 效應(yīng)，且目前很少報(bào)道大于2000 U/ml 濃度的病例，因此大大提高了臨床診斷的可靠性；該試劑盒的靈敏度較高，可以達(dá)到1.07 U/ml；對(duì)于卵巢癌這類(lèi)惡性程度很高的腫瘤來(lái)說(shuō)，該試劑盒為其早期診斷、判斷療效和預(yù)后提供了重要依據(jù)。

4.3 在激素類(lèi)方面的應(yīng)用

用TRFIA 檢測(cè)人類(lèi)人絨毛膜促性腺激素，靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)比RIA 高，激素的免疫測(cè)定也因此獲得了重大突破[21]。目前已用TRFIA 檢測(cè)了促甲狀腺激素、人絨毛膜促性腺激素、17α-羥孕酮、前列腺激素、促黃體激素等。而目前TRFIA 不但在人血清激素的檢測(cè)中使用普遍，還常用來(lái)測(cè)定動(dòng)物血清激素，比如對(duì)犬類(lèi)血清中的游離甲狀腺素4（free thyroxine 4，F(xiàn)T4）進(jìn)行了測(cè)定。

4.4 用于檢測(cè)先天性甲狀腺功能低下癥

先天性甲狀腺功能不足癥是由于不可控因素使甲狀腺的發(fā)育有變或代謝產(chǎn)生功能障礙，從而無(wú)法形成相應(yīng)的甲狀腺素而導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，甚至智力發(fā)育遲鈍。該病在新生兒期往往不易引起家長(zhǎng)甚至醫(yī)師的注意而延誤診斷或治療，因此影響患兒的大腦發(fā)育。目前，臨床上在檢測(cè)甲狀腺功能低下癥時(shí)多采用心電圖檢測(cè)、功能檢查、血清甲狀腺激素水平檢測(cè)等。TRFIA 法是一種可對(duì)其作出早期診斷的有效方法[22-23]，通過(guò)采用TRFIA 對(duì)患者血清做甲狀腺功能檢測(cè)，當(dāng)鑭系離子螯合物與血清里的甲狀腺激素結(jié)合時(shí)會(huì)產(chǎn)生一種膠狀分子團(tuán)，該分子團(tuán)會(huì)在紫外光激發(fā)下顯示出較強(qiáng)的熒光，能夠明顯加強(qiáng)信號(hào)值，從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4.5 用于檢測(cè)唐氏綜合征

應(yīng)用TRFIA 對(duì)妊娠孕婦的血清進(jìn)行生物標(biāo)記，進(jìn)行產(chǎn)前唐氏綜合征的篩選，是一項(xiàng)無(wú)創(chuàng)傷性的檢測(cè)手段[24]。對(duì)比早孕妊娠女性血清中的相關(guān)蛋白A（pregnancy associated plasma protein A，PAPP-A）的比例變化對(duì)研究唐氏綜合征，甚至流產(chǎn)的早期治療和監(jiān)測(cè)都有很大的實(shí)用價(jià)值。通過(guò)采用TRFIA 檢測(cè)血清中PAPP-A，結(jié)果顯示，孕早期婦女血清PAPP-A 水平隨孕周增加而呈上升趨勢(shì)（P＜0.05），隨孕婦年齡增長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)（P＜.05），隨體質(zhì)量指數(shù)增加而呈下降趨勢(shì)（P＜0.05），因此，TRFIA 可作為孕早期唐氏篩查的一項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)妊娠結(jié)果預(yù)判有一定參考價(jià)值。相對(duì)于傳統(tǒng)唐氏篩查，通過(guò)TRFIA 測(cè)定孕早期婦女血清PAPP-A 水平，可有效提高唐氏綜合征檢出率，且對(duì)胎兒無(wú)創(chuàng)傷，對(duì)篩查出的高危孕婦進(jìn)一步采取核實(shí)確診，避免了對(duì)所有孕早期婦女進(jìn)行有創(chuàng)檢查，從而降低了產(chǎn)前診斷的盲目性。

4.6 用于檢測(cè)寄生蟲(chóng)

早在1987年就有報(bào)道使用TRFIA 和ELISA 兩種方法分別對(duì)包蟲(chóng)病患者血清、其他寄生蟲(chóng)患者血清及健康患者對(duì)照血清進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果TRFIA 法的陽(yáng)性檢出率可達(dá)95.1%，高于ELISA 法的81.4%，因此TRFIA 法的靈敏度高于ELISA 法。2014年，Xu 等[25]建立的TRFIA 能夠檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)重組谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2蛋白的抗原，靈敏度能夠達(dá)到95.80%，特異度為93.6%，與交叉反應(yīng)物質(zhì)（如血吸蟲(chóng)、鞭蟲(chóng)等）的交叉反應(yīng)不超過(guò)10%。

4.7 其他

TRFIA在其他醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中曾被廣泛用來(lái)檢測(cè)p-淀粉樣蛋白分泌抑制因子、體液中的組胺、腫瘤壞死因子等的濃度含量[11]；也有研究人員使用該技術(shù)對(duì)端粒酶的活性以及心肌類(lèi)項(xiàng)目（如肌鈣蛋白T：Troponin T）進(jìn)行測(cè)定[26]。

5 總結(jié)與展望

TRFIA 技術(shù)是一種靈敏度高、特異度好、安全有效的超微量物質(zhì)分析測(cè)定方法，經(jīng)過(guò)40年的迅速發(fā)展，已成為臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)的主要技術(shù)手段。相信隨著生物醫(yī)學(xué)與檢測(cè)技術(shù)的迅速發(fā)展、交叉學(xué)科更深入的融合、檢測(cè)設(shè)備更加廣泛的應(yīng)用以及各種檢測(cè)試劑盒的不斷研發(fā)，TRFIA 技術(shù)將得到更進(jìn)一步的發(fā)展，推出越來(lái)越多更完善、更簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，在醫(yī)療領(lǐng)域或其他領(lǐng)域發(fā)揮更大的價(jià)值。