劉乃更，廖 睿，楊占全，梅 杰，李曉東,，3，胡清彪,3

(1.盤錦光合蟹業(yè)有限公司，遼寧省中華絨螯蟹育種重點實驗室，遼寧盤錦 124200；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽 110866；3.遼寧盤錦濕地生態(tài)系統(tǒng)國家野外觀測研究站，遼寧沈陽 110866)

稻漁共生系統(tǒng)是人類利用稻田淺水環(huán)境將水稻和水生生物種養(yǎng)在同一稻田空間而形成的獨特稻作系統(tǒng)[1]。2010 年以來，稻漁綜合種養(yǎng)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展得到國家政策、技術(shù)推廣、科學(xué)研究多方面的強有力支持[2]，如今在我國有各式各樣的稻田種養(yǎng)復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)，主要以稻田養(yǎng)魚、稻田養(yǎng)蝦、稻田養(yǎng)鴨和稻田養(yǎng)蟹為主[3]。稻蟹種養(yǎng)在溫度相對冷涼的東北地區(qū)及寧夏黃河罐區(qū)發(fā)展較快，尤其是以遼寧盤錦為主要代表，形成了稻蟹雙贏的“盤山模式”[2]，帶動了我國北方地區(qū)稻蟹種養(yǎng)新技術(shù)的發(fā)展。2018年遼寧省稻蟹種養(yǎng)面積全國排名第一[2]。

稻蟹綜合種養(yǎng)是以水稻生產(chǎn)為主體，同時適量放養(yǎng)中華絨螯蟹(河蟹)，達(dá)到一田兩用，一田兩收的效果。稻漁綜合種養(yǎng)可以改善稻田土壤的理化性狀，延長水稻生育期，增加生物量[4-6]。土壤微生物是物質(zhì)循環(huán)的調(diào)節(jié)者，在土壤有機物的分解和養(yǎng)分循環(huán)中起重要作用[7-9]。稻蟹共生系統(tǒng)可以降低土壤容重，提高土壤中有機質(zhì)的含量，且水稻產(chǎn)量高于常規(guī)單作稻田[10]，佟德利等[11]研究了水稻不同生育期根際微生物區(qū)系的變化，同時也研究了稻蟹生態(tài)種養(yǎng)對水稻根際微生物區(qū)系的影響[12]， 但只針對成蟹養(yǎng)成階段的根際土壤區(qū)系，目前尚未有針對河蟹從大眼幼體投入稻田到成長為幼蟹階段(扣蟹)的稻田土壤微生物的研究。該研究通過對稻蟹(扣蟹)共作稻田及單作稻田土壤微生物進(jìn)行分離鑒定，揭示稻蟹共生系統(tǒng)對土壤微生物的影響，為后期稻蟹綜合種養(yǎng)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗田位于遼寧省盤錦市盤錦光合蟹業(yè)有限公司稻蟹種養(yǎng)科學(xué)試驗田(取樣點坐標(biāo)：北緯40°54′3″，東經(jīng)121°50′37″)，供試水稻為盤錦當(dāng)?shù)胤N植較為廣泛的耐鹽堿水稻品種“鹽豐47號”，供試稻田為稻蟹(扣蟹)共作稻田和單作稻田兩種模式。中華絨螯蟹幼蟹由盤錦光合蟹業(yè)有限公司提供(中國第一個中華絨螯蟹新品種“光合1號”)。

1.2 試驗設(shè)計

土壤采集時間為2021年4月15日。采用S型5點取樣法采集4次表層土壤(0～20cm)，將每次采集的土樣進(jìn)行風(fēng)干處理，再轉(zhuǎn)移到2mm的土篩上過篩混勻，篩出土壤中的石子和植物根系等雜質(zhì)，兩種模式土樣各采集10g。如果最后過篩剩余土樣過多，采用常用的四分取樣法，將土樣置于光滑平面上進(jìn)行處理，首先均勻土壤厚度，同時規(guī)整成正方形，接下來沿兩條對角線將土壤均分為4份等量土壤，再取相對兩份土壤，執(zhí)行上述相同操作，多次重復(fù)，直至每份重量與取樣量相近再進(jìn)行取樣。

1.3 土壤pH測定

土壤pH測定時稱取2mm孔徑篩的風(fēng)干試樣10g于50mL高型燒杯中，加入無CO2的純水25mL(土液比為1:2.5)，用攪拌器攪拌1mins，使土粒充分分散，放置30mins后進(jìn)行測定。通過pH計(上海雷磁PHS-3C)進(jìn)行pH測定，讀取讀數(shù)為樣品土壤pH值，所測結(jié)果通過SPSS 20.0進(jìn)行單因素ANOVA分析。

1.4 培養(yǎng)基的制作

選用PDA培養(yǎng)基、改良高氏Ⅰ號培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(青島海博生物公司)。制備的培養(yǎng)基滅菌后分別倒入3個平板，本試驗均在無菌條件下操作，移液槍吸取0.1mL相應(yīng)濃度土壤稀釋液(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基選用10-5～10-7的土壤稀釋濃度，其他三種培養(yǎng)基均使用10-3～10-5的土壤稀釋濃度)接種在平板上，涂布均勻。分離、提純培養(yǎng)優(yōu)勢菌群，挑取幾種比較典型的優(yōu)勢菌落接種于相應(yīng)的平板，培養(yǎng)條件如表1。

表1 培養(yǎng)基及條件

1.5 活菌計數(shù)

用稀釋水樣檢測平板的菌落計數(shù)方法進(jìn)行計數(shù)，記錄各個平板的菌落總數(shù)。經(jīng)過培養(yǎng)基培養(yǎng)，統(tǒng)計培養(yǎng)皿菌落數(shù)目，活菌總數(shù)除以培養(yǎng)基滴加的稀釋液體積(0.1mL)再乘上稀釋倍數(shù)，所得結(jié)果即活菌數(shù)。參照鐘文輝等[13]的方法，選用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)、物種豐富度指數(shù)(S)和Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(D)討論兩種養(yǎng)殖模式土壤的微生物多樣性特征。

1.6 基因擴增

采用DNA提取試劑盒對不同菌落進(jìn)行總DNA的提取(天根生化科技(北京)有限公司)。該試驗用于細(xì)菌16S DNA基因擴增的引物序列[14]為：27F：5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，擴增程序為：94℃預(yù)變性4mins；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，持續(xù)30個循環(huán)；最后72℃末端延伸10mins。

用于真菌18S DNA基因擴增的引物序列[15]為：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，擴增程序為：94℃預(yù)變性5mins；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s，持續(xù)35個循環(huán)；最后72℃末端延伸7mins。

1.7 測序比對

將PCR擴增后含有目的片段的擴增產(chǎn)物送生工測序，測序所得序列于DNAman進(jìn)行正反拼接，根據(jù)測序所得序列在NCBI中進(jìn)行基本局部序列比對(Basic local alignment search tool，BLAST)，驗證目的片段是否有細(xì)菌或真菌片段，根據(jù)比對結(jié)果進(jìn)行微生物菌群的種屬鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種稻田土壤pH值

通過對無蟹稻田和稻蟹共作土壤pH的檢測，發(fā)現(xiàn)無蟹稻田比有蟹稻田土壤pH略高(表2)，但差異不顯著(p>0.05)。

表2 兩種稻田土壤樣本pH值

2.2 活菌計數(shù)

培養(yǎng)基活菌數(shù)顯示了不同菌群的數(shù)量，突顯出個別菌群的優(yōu)勢，無菌土壤和扣蟹土壤樣品中的活菌數(shù)如表3、表4所示。

表3 無蟹土壤樣品的活菌計數(shù)

表4 扣蟹土壤樣品的活菌計數(shù)

無蟹稻田土壤中有19種菌的活菌數(shù)大于103個/每克土壤，其中有12種菌的活菌數(shù)大于104個/每克土壤，有8種菌的活菌數(shù)大于105個/每克土壤，有4種菌的活菌數(shù)大于106個/每克土壤(表3)。

稻蟹共作土壤中有31種菌的活菌數(shù)大于103個/每克土壤，其中有9種菌的活菌數(shù)大于104個/每克土壤，有4種菌的活菌數(shù)大于106個/每克土壤(表4)。

從無蟹稻田和稻蟹共作的土樣中分離培養(yǎng)出來的菌群在培養(yǎng)基上呈現(xiàn)的菌落形態(tài)各異，有的表面光滑，有的表面粗糙，有的邊緣整齊，有的菌落邊緣無規(guī)則，大小和顏色也各不相同，由此將不同表型的菌落進(jìn)行標(biāo)號提純培養(yǎng)，并通過16S rDNA、18S rDNA進(jìn)行菌種擴增鑒定。

根據(jù)Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)計算公式得到結(jié)果如表5。發(fā)現(xiàn)無蟹稻田Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)要高于稻蟹共作，但物種豐富度(S)及Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(D)低于稻蟹共作。

表5 不同土壤類型菌類多樣性、豐富度和優(yōu)勢度指數(shù)比較

2.3 測序結(jié)果統(tǒng)計

無蟹稻田和稻蟹共作土壤細(xì)菌組成種類存在較大差異(表6)。無蟹稻田土壤和稻蟹共作土壤的共同細(xì)菌有3種，分別為葉球形微桿菌(Microbacteriumglobosum)、水生芽孢桿菌(Bacillusaquimaris)、假單胞菌(Pseudomonassp.strain)。無蟹稻田存在3個細(xì)菌屬，分別為微桿菌屬(Microbacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)；稻蟹共作存在9種細(xì)菌菌種，隸屬于5個屬，分別為微桿菌屬(Microbacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和乳酸桿菌屬(MicrobacteriumII)。其中稻蟹共作土壤特有3種細(xì)菌，分別是乳酸桿菌(Microbacteriumlacusstrain)、氧化微桿菌(Microbacteriumoxydansstrain)和節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)。

表6 土壤細(xì)菌區(qū)系

無蟹稻田和稻蟹共作土壤真菌組成種類存在較大差異(表7)。無蟹稻田土壤和稻蟹共作土壤的共同真菌屬有4種，分別為枝孢菌屬(Cladosporiu)、藍(lán)狀菌屬(Talaromyces)、短梗霉菌屬(Aureobasidium)、粘霉菌(Vishniacozymacarnescens)。無蟹稻田存在15種真菌，隸屬于10個屬，其中枝孢菌屬(Cladosporium)包含4種、青霉菌屬(Penicillium)包含2種、鏈格孢菌屬(Alternaria)包含2種等。無蟹稻田土壤特有6種真菌，分別為苦蕎酵母菌(Buckleyzymaaurantiacastrain)、美鏈霉菌(Talaromycesamestolkiae)、短密青霉菌(Penicilliumbrevicompactum)、枝孢菌屬(Cladosporiumsp.)、假枝孢菌(Cladosporiumpseudocladosporioidesstrain)、鏈格孢(Alternarianees)。稻蟹共作存在19種真菌，隸屬于10個屬，其中枝孢菌屬(Cladosporium)包含5種、鏈格孢菌屬(Alternaria)包含4種，被孢霉菌屬(Mortierella)和曲霉屬(Aspergillus)均包含2種。稻蟹共作土壤特有10種真菌，其中包含1種不同的枝孢菌屬(Cladosporium)以及2種不同的鏈格孢菌(AlternariaNeessp.)，除此之外還有疣孢藍(lán)狀菌(Talaromycesverruculosus)、被孢霉(Mortierella)、隱球菌屬(Cryptococcussp.)、灰綠青霉(Penicilliumglaucum)、單胞菌(Monospora)、詹森曲霉(Aspergillusjenseniistrain)、細(xì)交鏈格孢(Alternaria)。

表7 土壤真菌區(qū)系

3 討論

3.1 稻蟹共作對土壤pH值的影響

稻田土壤微生物是稻田土壤生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，有研究發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)養(yǎng)殖動物可以通過攝食及排泄等生命活動有效改善土壤的透氣性和土壤細(xì)菌營養(yǎng)條件，進(jìn)而提高了土壤微生物的多樣性和活性[16, 17]，該研究兩種稻田類型土壤樣本的pH值發(fā)生了變化，表現(xiàn)為與水稻單作(無蟹稻田)相比，稻蟹共作(稻蟹共作)的pH下降，但差異不顯著，這與宋宇等[18]研究結(jié)果河蟹共作稻田和龍蝦共作稻田的pH均低于水稻單作一致，但差異顯著性不一致，該研究稻田養(yǎng)殖河蟹階段為大眼幼體到扣蟹階段，推測可能受稻田中河蟹規(guī)格大小影響。

3.2 稻蟹共作對土壤微生物的影響

土壤理化性質(zhì)會影響微生物的生長活性[19]，本研究發(fā)現(xiàn)稻蟹共作土壤比無蟹稻田土壤中的細(xì)菌種類和真菌種類均高于無蟹稻土壤，這與佟得利等[12]的研究結(jié)果一致。土壤的性質(zhì)影響土壤微生物的多樣性，而微生物的多樣性也反作用于土壤的功能[20, 21]，稻蟹共作模式可以改善土壤的生態(tài)環(huán)境，本次研究發(fā)現(xiàn)不同稻蟹種養(yǎng)科學(xué)試驗田中的細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)組成及種類存在一定的相似性，但也存在差異，從屬的分類地位來看，稻蟹共作土壤細(xì)菌中微桿菌屬和節(jié)桿菌屬為優(yōu)勢菌，真菌枝孢菌屬和鏈格孢菌屬為優(yōu)勢菌。王伏偉[22]通過高通量測序?qū)κ┓始敖斩掃€田細(xì)菌群落的研究表明，不施肥情況下，小麥秸稈還田和不還田的優(yōu)勢菌門為放線菌門、擬桿菌門、變形菌門和酸桿菌門，這一試驗結(jié)果與本結(jié)果相似，表明稻蟹共作具有還田的效用。

河蟹的活動會疏松土壤，達(dá)到增氧的效果，即稻田養(yǎng)蟹會提高稻田環(huán)境的溶解氧濃度，有研究結(jié)果表明[19, 23, 24]，在一定范圍內(nèi)，溶解氧濃度的升高可促進(jìn)被孢霉的生長，在低溶氧時，溶解氧的傳遞受到被孢霉的菌絲抑制，同時也不利于被孢霉的生長。該研究中稻蟹共作土壤中發(fā)現(xiàn)了被孢霉，而在無蟹稻田土壤中未發(fā)現(xiàn)，可能與河蟹活動有關(guān)。

該研究中稻蟹共作土壤較無蟹稻田土壤pH值有下降趨勢，研究表明[25]土壤pH值與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量關(guān)系密切，是造成土壤間細(xì)菌群落和數(shù)量差異性的主要原因。河蟹排泄物中富有有機養(yǎng)分，可以提高土壤肥力，從而降低土壤的酸堿度，研究表明[10]，稻蟹共作土壤的pH會比普通稻田土壤的低。紅曲霉菌絲體含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，紅曲霉可在酸性環(huán)境下生存繁殖，最適pH是4～5[26]，由此推斷，稻蟹共作較無蟹稻田中的紅曲霉的數(shù)量高的原因可能是受pH影響。兩種稻田土壤中均存在水生芽孢桿菌，其在不利條件下其產(chǎn)生芽孢，條件適當(dāng)可發(fā)展為營養(yǎng)體，有氧無氧條件下均可生存。水生芽孢桿菌可促進(jìn)植物的生長。

鏈格孢菌屬大部分種類不利于農(nóng)作物的生長，可寄生在農(nóng)作物上引起病害，導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量及質(zhì)量下降，也有少數(shù)鏈格孢菌具有殺蟲、殺菌等作用，雖無蟹稻田和稻蟹共作均存在鏈格孢菌，但稻蟹共作的鏈格孢菌種類和數(shù)量都高于無蟹稻田。馮中紅等研究表明，鏈格孢菌受營養(yǎng)物質(zhì)、pH值等環(huán)境因素影響[24]。

該試驗稻蟹共作的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)低于無蟹稻田，原因可能是稻蟹共作中微生物種類增加，但優(yōu)勢菌群增強了優(yōu)勢地位，導(dǎo)致H下降。與Shannon指數(shù)不同，稻蟹共作稻田土壤的物種豐富度(S)及Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(D)均高于無蟹稻田，Simpson指數(shù)與群落多樣性成正比，較弱勢及稀有種類對指數(shù)影響較低，而優(yōu)勢物種和普遍物種在優(yōu)勢度分析中具有較高影響力，對指數(shù)影響大，表明稻蟹共作改變了土壤微生物多樣性格局。

4 結(jié)論

兩種稻田土壤存在細(xì)菌和真菌，其中稻蟹共作土壤比單作稻田土壤多6種細(xì)菌，且稻蟹共作土壤特有3種細(xì)菌，分別是乳酸桿菌、氧化微桿菌和節(jié)桿菌，無蟹稻田土壤和稻蟹共作土壤的共同真菌屬有4種，其中枝孢菌屬和鏈格孢菌屬均是其優(yōu)勢菌。從種類上講，稻蟹共作土壤比單作稻田土壤多4種真菌，無蟹稻田土壤特有6種真菌，稻蟹共作土壤特有10種真菌。菌群結(jié)構(gòu)表明，養(yǎng)蟹稻田的土壤質(zhì)量較普通稻田有所提升，主要原因是河蟹的日常頻繁活動改變土壤本身的結(jié)構(gòu)，一方面起到松土的作用，另一方面其排泄物對土壤養(yǎng)分產(chǎn)生影響，由于該試驗鑒定出的一些菌屬現(xiàn)有研究較少，未來還需繼續(xù)深入研究。