王昆鵬 張建黨 董孟寧 劉素杰 徐廣建

膠質(zhì)瘤是最常見的惡性腦腫瘤[1]。近年來，膠質(zhì)瘤的研究已經(jīng)取得了很大進展，但是總體生存率仍未見明顯提高[2]。探索膠質(zhì)瘤發(fā)病機制，對于改善膠質(zhì)瘤的治療效果具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在表觀遺傳調(diào)控、細胞分化及細胞周期調(diào)控等過程中發(fā)揮重要作用，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3～6]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA小核仁RNA 宿主基因7（small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7）與前列腺癌[7]、胰腺癌[8]等增殖和侵襲有關(guān)。本文分析lncRNA SNHG7與膠質(zhì)瘤病人預(yù)后的關(guān)系及其對瘤細胞細胞侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 組織樣本來源 納入標(biāo)準(zhǔn)：病理檢查證實為膠質(zhì)瘤；術(shù)前未接受放療、化療或免疫治療；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤；合并嚴(yán)重心、肝、腎等臟器功能疾?。缓喜⒚庖呋虼x性疾病。選取2015年6 月至2016 年3 月符合上述標(biāo)準(zhǔn)的膠質(zhì)瘤80 例，其中男48 例，女32 例；年齡28～72 歲，平均（47.01±9.23）歲；WHO分級為Ⅰ級10例，Ⅱ級22例，Ⅲ級22例，Ⅳ級26 例；術(shù)后隨訪截止2020 年4 月。另選取顱腦損傷顱內(nèi)減壓術(shù)中切取的非腫瘤腦組織50 例為對照，其中男26 例，女24 例；年齡23～68 歲，平均（46.80±6.27）歲。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 RT-PCR 檢測組織lncRNA SNHG7 水平TRIzol試劑（上海源葉生物科技有限公司）提取組織總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海一研生物科技有限公司）獲得cDNA，隨后用2×SYBR Green PCR Mastermix 試劑盒（上海一研生物科技有限公司），以cDNA為模板進行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃、10 min；95 ℃、30 s；60 ℃、15 s；72 ℃、20 s；40 個循環(huán)；72 ℃、10 min。用2-△△Ct法計算相對表達量。以表達量中位數(shù)為截斷值，分為高表達組和低表達組。

1.3 細胞培養(yǎng)及siRNA 轉(zhuǎn)染 膠質(zhì)瘤細胞株U87（中科院上海細胞庫）在含10%胎牛血清（上海唯科生物制藥有限公司）的DMEM F12培養(yǎng)基（上海唯科生物制藥有限公司）中進行培養(yǎng)。待細胞密度達到60%時，用Lipofectamine 2000試劑盒（上海吉凱基因科技有限公司）進行轉(zhuǎn)染，分別用sh-RNA（序列5'-CAAGGUCAUCCAUUCA-3'）或陰性對照轉(zhuǎn)染U87細胞，設(shè)置為sh-SNHG7 組、sh-CON 組。質(zhì)粒均由愛康得生物科技（蘇州）有限公司提供。轉(zhuǎn)染后用RTPCR檢測細胞lncRNA SNHG7相對表達量。

1.4 細胞侵襲和遷移檢測 用Transwell 實驗檢測膠質(zhì)瘤U87 細胞的侵襲和遷移。遷移實驗：在Transwell 小室（上海唯科生物制藥有限公司）上室加入5×104個U87 細胞，下室中加入600 μl 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；固定膜底細胞，隨后用0.1%結(jié)晶紫染色；顯微鏡下對細胞數(shù)量進行定量。侵襲實驗：使用預(yù)先加入Matrigel 膠（上海唯科生物制藥有限公司）的小室，上室加入5×104個U87細胞，培養(yǎng)48 h，隨后步驟同遷移實驗。

1.5 lncRNASNHG7對miR-4516的靶向調(diào)控作用 用TargetScan 發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG7 與miR-4516 有互補結(jié)合位點。隨后用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C二者的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。試劑盒購于深圳市默賽爾生物醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司。將lncRNA SNHG7突變型熒光酶報告載體（PGLO-SNHG7-MUT）、野生型熒光素酶報告載體（PGLO-SNHG7-WT）分別同miR-4516 模擬物（miR-4516 mimics）、模擬陰性對照（miR-NC）或抗miR-4516（anti-miR-4516）共轉(zhuǎn)染細胞，隨后檢測熒光素酶活性。為進一步驗證lncRNA SNHG7對miR-4516的靶向調(diào)控作用，用質(zhì)?；蜻^表達載體（愛康得生物科技（蘇州）有限公司提供）轉(zhuǎn)染U87細胞，將細胞分為miR-NC 組、miR-4516 mimics組、anti-miR-4516 組，檢測lncRNA SNHG7 相對表達水平；pcDNA3.1 組、pcDNA3.1-SNHG7 組、sh-NC組、sh-SNHG7組，檢測miR-4516相對表達水平。

1.6 lncRNA SNHG7調(diào)控miR-4516對膠質(zhì)瘤細胞侵襲和遷移的影響 分別用sh-SNHG7質(zhì)粒、anti-miR-4516、陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U87 細胞，將細胞分為sh-NC+miR-NC組、sh-SNHG7+miR-NC組、sh-SNHG7+anti-miR-4516組，檢測各組細胞侵襲和遷移。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件分析；計量資料用±s表示，用t檢驗和單因素方差分析、LSD-t 檢驗；用多因素Cox 比例回歸風(fēng)險模型分析生存預(yù)后影響因素；Kaplan-Meier曲線分析lncRNA SNHG7表達水平與與生存預(yù)后的關(guān)系；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤組織lncRNA SNHG7 表達水平及其與病人生存預(yù)后的關(guān)系 膠質(zhì)瘤組織lncRNA SNHG7 相對表達量明顯高于對照組（P＜0.05，圖1A）。多因素Cox 回歸分析顯示，lncRNA SNHG7高表達是膠質(zhì)瘤病人不良生存預(yù)后的獨立影響因素（P＜0.05，表1）。生存曲線分析顯示，高表達組膠質(zhì)瘤病人中位總生存期較低表達組明顯縮短（P＜0.05；圖1B）。

表1 本文80例膠質(zhì)瘤生存預(yù)后影響因素的Cox回歸分析

圖1 膠質(zhì)瘤組織lncRNA SNHG7 表達水平變化及其與病人生存預(yù)后的關(guān)系A(chǔ). 膠質(zhì)瘤組織lncRNA SNHG7 表達變化，與對照組相比，* P＜0.05；B.生存曲線分析lncRNA SNHG7 表達水平與膠質(zhì)瘤病人生存預(yù)后的關(guān)系

2.2 下調(diào)lncRNA SNHG7 對膠質(zhì)瘤U87 細胞侵襲和遷移的影響 與sh-CON 組比較，sh-SNHG7 組lncRNA SNHG7 相對表達量、侵襲能力和遷移能力均明顯降低（P＜0.05；圖2）。

圖2 敲低lncRNa SNHG7表達對膠質(zhì)瘤U87細胞侵襲和遷移的影響

2.3 lncRNA SNHG7 對miR-4516 的靶向調(diào)控作用TargetScan 預(yù)測lncrNA SNHG7 和miRNA-4516 有結(jié)合位點（圖3A）。膠質(zhì)瘤U87 細胞轉(zhuǎn)染miR-4516 mimics 后PGLO-SNHG7-WT 的熒光素酶活性明顯受到抑制，而anti-miR-4516 可以增強PGLO-SNHG7-WT 的熒光素酶活性（P＜0.05，圖3B）。轉(zhuǎn)染miR-4516 mimics 后，膠質(zhì)瘤U87 細胞lnc RNA SNHG7 表達水平明顯下降，而轉(zhuǎn)染anti-miR-124 可使膠質(zhì)瘤U87細胞LNCRNA SNHG7表達水平升高（P＜0.05，圖3C）。膠質(zhì)瘤U87 細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SNHG7 后，miR-4516 表達水平明顯降低（P＜0.05，圖3D）。以上結(jié)果表明lncRNA SNHG7 靶向調(diào)控miR-4516。

圖3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞ClncRNA SNHG7 靶向調(diào)控miR-4516

2.4 lncRNA SNHG7 調(diào)控miR-4516 對膠質(zhì)瘤U87 細胞侵襲和遷移的影響 與sh-NC+miR-NC 組比較，sh-SNHG7+miR-NC 組U87 細胞侵襲和遷移能力均明顯下降（P＜0.05）。與sh-SNHG7+miR-NC 組比較，sh-SNHG7+anti-miR-4516組侵襲和遷移能力均明顯提高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 lncRNA SNHG7 靶向調(diào)控miR-4516 表達對膠質(zhì)瘤U87細胞侵襲和遷移的影響

3 討論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，由于膠質(zhì)瘤的侵襲性，手術(shù)很難完全切除，術(shù)后易復(fù)發(fā)，而且膠質(zhì)瘤通常發(fā)生放化療抵抗現(xiàn)象，因此，膠質(zhì)瘤預(yù)后不理想。需要進一步研究膠質(zhì)瘤進展的機制來確定和發(fā)展新的治療策略。近年來，尋找膠質(zhì)瘤生物學(xué)標(biāo)志物是研究熱點，其中l(wèi)ncRNA在膠質(zhì)瘤中的作用逐漸受到重視[9]。lncRNA SNHG7 位于染色體9q34.3，全長984 bp。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG7具有癌基因的作用，其失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生和進展有關(guān)[7，8]。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG7 在膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)，lncRNA SNHG7 高表達是膠質(zhì)瘤不良生存預(yù)后的獨立影響因素，沉默lncRNA SNHG7 表達后，膠質(zhì)瘤U87 細胞的侵襲及遷移能力明顯下降。這提示lncRNA SNHG7在膠質(zhì)瘤中可能起到癌基因的作用，促進腫瘤進展。

lncRNA SNHG7 是最近發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，其表達上調(diào)促進腫瘤的增殖和存活。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG7 在乳腺癌組織中顯著上調(diào)，應(yīng)用siRNA 敲低lncRNA SNHG7 的表達顯著抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲，其機制與靶向調(diào)控miRNA-381有關(guān)[10]。She等[11]發(fā)現(xiàn)肺癌組織lncRNA SNHG7表達明顯升高，通過增強FAIM2 表達促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG7可以提供靶向不同miRNA促進膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲、遷移[12～16]。

我們應(yīng)用TargetScan 預(yù)測顯示lncRNA SNHG7和miRNA-4516 有結(jié)合位點；用雙熒光素酶報告實驗證實miRNA-4516是lncRNA SNHG7的靶基因；轉(zhuǎn)染miR-4516 mimics 后，膠質(zhì)瘤U87 細胞SNHG7 表達水平明顯下降，而轉(zhuǎn)染anti-miR-124 可使膠質(zhì)瘤U87 細胞lncRNA SNHG7 表達水平明顯升高；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SNHG7，膠質(zhì)瘤U87 細胞miR-4516 表達水平明顯降低。這證實lncRNA SNHG7可以靶向調(diào)控miR-4516。研究發(fā)現(xiàn)，miR-4516 在膠質(zhì)母細胞瘤[17]、肝細胞癌[18]等中發(fā)揮癌基因作用，促進腫瘤細胞增殖、侵襲及遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染sh-SNHG7質(zhì)粒后膠質(zhì)瘤細胞的侵襲及遷移能力明顯下降，而共轉(zhuǎn)染sh-SNHG7 和anti-miR-4516 后侵襲和遷移力又明顯升高，說明lncRNA SNHG7 可以通過靶向調(diào)控miR-4516促進膠質(zhì)瘤細胞的侵襲和遷移。

總之，膠質(zhì)瘤組織lncRNA SNHG7呈高表達，與病人不良生存預(yù)后有關(guān)。lncRNA SNHG7 通過靶向調(diào)控上調(diào)miR-4516 表達促進膠質(zhì)瘤細胞的侵襲和遷移。