贠 晗,李嘉欣,羅冬艷,劉曉玲

(煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005)

STS基因,即類固醇硫酸酯酶基因,其產(chǎn)物STS蛋白常存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔或高爾基體中,能作用于類固醇硫酸鹽等底物,催化底物的硫酸酯鍵發(fā)生斷裂,而類固醇硫酸鹽是雌激素、雄激素和膽固醇的代謝前體[1],故STS基因可在激素代謝途徑中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),人體內(nèi)STS蛋白可以調(diào)節(jié)多種組織中雌激素和雄激素的活化[2-3]。STS還可以作用于膽固醇硫酸鹽,使其脫硫生成膽固醇[4]。

目前,STS基因的克隆、表達(dá)和表征研究主要集中在哺乳動(dòng)物中[5],在非哺乳動(dòng)物中,僅有基因組學(xué)測(cè)序后獲得的相應(yīng)STS序列,組織表達(dá)特性及功能相關(guān)研究尚未可見[6]。本研究對(duì)櫛孔扇貝STS基因CDS序列特征、組織表達(dá)特征、性腺發(fā)育周期表達(dá)特征進(jìn)行了檢測(cè)分析,以期為后續(xù)研究該基因在櫛孔扇貝性腺發(fā)育中的具體作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)均購(gòu)自煙臺(tái)崆峒島,選取健康扇貝于過濾海水中暫養(yǎng)過夜, 取各發(fā)育時(shí)期的性腺,一部分通過組織切片對(duì)發(fā)育時(shí)期進(jìn)行鑒定,即增殖期、生長(zhǎng)期、成熟期[7],剩余部分液氮速凍后存于-80 ℃冰箱,用于提取RNA;選取發(fā)育同步的雌雄各組織,包括性腺、閉殼肌、腎臟、外套膜、鰓、肝胰腺,液氮速凍后于-80 ℃冰箱,以提取RNA[8]。上述樣本取樣數(shù)各為5個(gè)。

1.2 總RNA的提取與cDNA的合成

柱式動(dòng)物RNAout試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)提取各組織RNA,提取的RNA經(jīng)電泳及超微量分光光度計(jì)檢測(cè),檢驗(yàn)合格的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA(反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司),保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 STS基因CDS序列分析

利用本實(shí)驗(yàn)室已有櫛孔扇貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(本實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表數(shù)據(jù)),進(jìn)行序列分析與引物設(shè)計(jì),利用Clustal X和DNAman軟件進(jìn)行同源序列比對(duì);利用MEGA 7軟件,采用鄰接法(Neibor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 STS基因在各組織及性腺發(fā)育周期的qRT- PCR

qRT-PCR特異引物為sq1/sq2(表1),內(nèi)參基因β-actin引物為A1/A2。每個(gè)組織設(shè)置3個(gè)樣本重復(fù),每個(gè)樣本設(shè)置2個(gè)技術(shù)重復(fù),使用ABI7500型熒光定量PCR儀擴(kuò)增:95 ℃10 min、(95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s)×40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量,以SPSS軟件中One-way ANOVA進(jìn)行顯著性分析,最小顯著差法(Least Significant Difference,LSD)多重檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(P<0.05為顯著水平)[9]。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 櫛孔扇貝性腺發(fā)育時(shí)期的組織鑒定

如圖1所示,增殖期的精巢和卵巢中,性腺的濾泡內(nèi)僅可見1～2層生殖細(xì)胞;而生長(zhǎng)期的精巢和卵巢中,性腺的濾泡腔內(nèi),更多的生殖細(xì)胞出現(xiàn)在濾泡壁上;成熟期的精巢和卵巢中,濾泡內(nèi)充滿了大量生殖細(xì)胞。

圖1 櫛孔扇貝性腺發(fā)育不同時(shí)期的組織學(xué)觀察

2.2 STS基因CDS序列特征與分析

如圖2所示,櫛孔扇貝STS基因CDS 長(zhǎng)1755 bp,編碼584個(gè)氨基酸。STS蛋白序列多重序列比對(duì)結(jié)果(圖3)顯示,櫛孔扇貝STS蛋白具有與其他物種一樣的高度保守結(jié)構(gòu)域:A、B和C,還具有硫酸酯酶家族基因特有的保守半胱氨酸[10-11]。

圖2 櫛孔扇貝STS基因CDS序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

如圖4所示,櫛孔扇貝STS蛋白首先與蝦夷扇貝的STS聚類,然后再與牡蠣聚類,最后與其他物種的STS蛋白聚類,這一結(jié)果與物種分類地位基本一致。

圖4 不同物種STS蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.4 STS基因的qRT-PCR結(jié)果

如圖5和圖6,STS基因在雌雄各組織中均有表達(dá),說明其表達(dá)具有組織廣泛性;雌性各組織中,卵巢中的表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05),而雄性各組織中,表達(dá)量無顯著差別。如圖7所示,性腺周期中,STS基因在增殖期卵巢中的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期的性腺。在卵巢中,該基因在性腺發(fā)育早期的增殖期表達(dá)量顯著高于發(fā)育后期,約為生長(zhǎng)期的17.3倍,成熟期的22.4倍;而在精巢中,其表達(dá)量隨性腺發(fā)育無顯著差異。

不同字母表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

不同字母表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

不同字母表示相同組織不同組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

櫛孔扇貝STS基因序列的N端含A、B、C三個(gè)保守區(qū),其中B結(jié)構(gòu)域包含發(fā)揮重要酶功能的進(jìn)化保守區(qū)(ECRs)活性位點(diǎn),不同物種該基因的B結(jié)構(gòu)域相似度在90%以上,除B保守區(qū)外其他保守區(qū)也含有發(fā)揮水解底物催化功能的氨基酸[12]。序列分析還發(fā)現(xiàn)，櫛孔扇貝STS具有硫酸酯酶中被2-氨基-3-氧丙酸殘基取代的保守半胱氨酸殘基,研究表明催化性硫酸酯酶的生成與半胱氨酸殘基轉(zhuǎn)化為2-氨基-3-氧丙酸殘基之間存在關(guān)聯(lián),這種轉(zhuǎn)化是產(chǎn)生具有催化活性硫酸酯酶的必要條件[10]。

REED等[1]發(fā)現(xiàn)STS廣泛表達(dá)于人體的多個(gè)組織器官,幾乎無處不在,具表達(dá)廣泛性,常見于人類的生殖道靶細(xì)胞(子宮內(nèi)膜、卵巢、前列腺、睪丸、胎盤),乳房、皮膚、大腦骨骼和血液中,主要調(diào)節(jié)激素的活化。本研究發(fā)現(xiàn)STS在櫛孔扇貝不同組織中的表達(dá)也具廣泛性,與高等動(dòng)物中的研究結(jié)果類似。周志楠等[13]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黔北麻羊(Ovislinnaeus)卵巢、垂體、子宮、輸卵管、下丘腦五個(gè)組織中STS廣泛表達(dá),其中,卵巢表達(dá)量最高,推測(cè)認(rèn)為該基因與合成性激素的關(guān)鍵酶有關(guān),其在卵巢中的高表達(dá)對(duì)雌激素分泌具有影響。李嗣杰[14]認(rèn)為STS蛋白可水解雌激素前體生成有活性的雌激素,PUROHIT等[15]認(rèn)為STS是雌激素生成的一條途徑中的關(guān)鍵酶。

本研究發(fā)現(xiàn)STS在櫛孔扇貝卵巢中的表達(dá)量顯著高于其他組織,推測(cè)STS基因在櫛孔扇貝卵巢中的相對(duì)高表達(dá),或許也與其在雌激素生成和活化中發(fā)揮的作用相關(guān),這一發(fā)現(xiàn),或?yàn)榈偷壬镏蠸TS的相關(guān)研究奠定理論基礎(chǔ)。

PAATELA等[16]發(fā)現(xiàn),STS在女性青春期前的卵巢中表達(dá)量最高,但此時(shí)期雌激素水平顯著低于青春期,這種生理活動(dòng)上的表達(dá)上調(diào),可能是一種組織特異性雌激素激活的調(diào)控機(jī)制,并為后續(xù)青春期雌激素的大量產(chǎn)生做準(zhǔn)備。本研究發(fā)現(xiàn),STS在櫛孔扇貝卵巢發(fā)育周期中增殖期的表達(dá)量最高,但此時(shí)卵巢中E2的含量也顯著低于發(fā)育后期[17],這一規(guī)律與PAATELA對(duì)女性卵巢中STS的研究類似,推測(cè)扇貝中該時(shí)期STS含量的顯著增高也是為后續(xù)成熟期雌激素的大量產(chǎn)生做準(zhǔn)備。人體E2來源主要有幾個(gè)途徑,膽固醇經(jīng)線粒體內(nèi)細(xì)胞素側(cè)鏈裂解酶催化形成孕烯醇酮,孕烯醇酮生成DHEA,DHEA在3β-HSD作用下脫氫生成A2,一部分A2在17β-HSD作用下進(jìn)一步生成T,另外一部分A2在CYP19作用下生成E1,E1再通過還原性的17β-HSD轉(zhuǎn)化為E2;STS參與的一條途徑為DHEAS脫硫生成DHEA,DHEA再經(jīng)上述途徑生成激素,另一條途徑為E1S脫硫生成E1,E1在17β-HSD作用下轉(zhuǎn)化為E2[2-3]。STS參與E2生成活化的機(jī)制研究目前主要集中在人體中,其他物種中較少,KUROGI等[5]克隆了斑馬魚和人的STS基因,并通過外源表達(dá)制備了相應(yīng)的STS蛋白,進(jìn)一步比較了所制備的STS蛋白對(duì)底物膽固醇硫酸鹽、DHEA-S和E1-S的催化效率,發(fā)現(xiàn)斑馬魚與人類體外原核表達(dá)的STS酶活相當(dāng),研究者推測(cè)STS的生理功能在斑馬魚和人類之間可能是保守的,也說明其外源表達(dá)的STS無需剪切加工即為具有酶活性的蛋白產(chǎn)物。但STS在低等海洋無脊椎動(dòng)物中的相關(guān)研究幾乎不可見。本研究推測(cè),或許與在人體中的作用途徑類似,STS在扇貝卵巢中也僅通過部分途徑參與活化生成E2,發(fā)育后期E2的大量生成可能還有其他激素生成途徑發(fā)揮作用,具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。劉建國(guó)研究發(fā)現(xiàn),增殖期卵巢中E2含量最低但此時(shí)期T的含量卻最高[17]。周英俏研究發(fā)現(xiàn),DHEA在雌性大鼠體內(nèi)優(yōu)先向雄激素而不是雌激素轉(zhuǎn)化[18]。結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)認(rèn)為,櫛孔扇貝增殖期卵巢中STS的顯著高表達(dá),可能也會(huì)發(fā)揮如人體中一樣的作用,即STS可將DHEA-S脫硫生成DHEA,從而可能和小鼠一樣優(yōu)先向雄激素轉(zhuǎn)化。