孫 倩,劉萬卉,紀(jì)云霞,王運(yùn)慶

(1.煙臺大學(xué)藥學(xué)院,分子藥理和藥物評價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺大學(xué)),新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 煙臺 264005;2.中國科學(xué)院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,煙臺海岸帶研究所,山東 煙臺 264003)

微/納塑料(microplastics, MPs/nanoplastics, NPs)作為一類新型顆粒污染物,已引起全世界科學(xué)家和民眾的廣泛關(guān)注[1-2]。微/納塑料不僅大量存在于環(huán)境中,也來源于日用塑料制品中。日用塑料制品在生產(chǎn)、儲存和應(yīng)用過程中,受到擠壓、搖晃、刺穿、摩擦等機(jī)械外力作用,可以形成大量MPs/NPs粒子[3-4]。這些粒子可通過經(jīng)口暴露、呼吸暴露和皮膚滲透等途徑進(jìn)入人體,對人類健康構(gòu)成潛在威脅[5-7]。揭示其細(xì)胞毒性和生物學(xué)效應(yīng)是亟待解決的重要問題。

MPs攝入量在空氣、飲用水和海鮮中占絕大多數(shù),其中室外空氣中含MPs大約為5.4 個(gè)/m3,一些環(huán)境相關(guān)濃度下MPs毒性的實(shí)驗(yàn)室研究中,通常使用1 mg/L作為MPs的暴露濃度閾值,該數(shù)值與多個(gè)現(xiàn)場調(diào)查中報(bào)告的最大濃度為相同數(shù)量級[8]。全球159個(gè)自來水樣本中,81%含有微塑料顆粒,大多數(shù)直徑小于5 μm,總平均濃度為5.45 個(gè)/L[9]。這些濃度數(shù)據(jù)具有現(xiàn)實(shí)的環(huán)境意義,盡管目前還沒有常規(guī)的方法可以檢測NPs,但預(yù)計(jì)它們至少與較大的MPs顆粒一樣豐富。根據(jù)人類可能暴露的環(huán)境培養(yǎng)基的一些研究,估計(jì)這些培養(yǎng)基的每日MPs劑量如下：空氣吸入每日MPs的暴露量為81個(gè),飲用水?dāng)z入每日MPs的暴露量為28個(gè),工業(yè)暴露中甚至約高達(dá)5～40 mg/m3[10]。雖然生活中真實(shí)暴露濃度遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)濃度,但考慮到MPs/NPs人體暴露濃度的不確定性、攝入率和組織蓄積等問題,本研究以MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果為指標(biāo),選擇響應(yīng)值較低的濃度進(jìn)行極性暴露實(shí)驗(yàn),以考察其慢性長期蓄積的生物效應(yīng)。

聚丙烯(polypropylene,PP)是一類重要的日用塑料材質(zhì),廣泛用于生產(chǎn)餐飲容器(餐盒、水杯、奶瓶等)和醫(yī)療用品(一次性注射器、輸液用包材、透析膜等),具有很高的人體暴露風(fēng)險(xiǎn),但目前尚未有對PP MPs/NPs的毒性進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道。針對上述問題,通過機(jī)械破碎和差速離心方法,制備了PP MPs/NPs模型粒子。選擇單核巨噬細(xì)胞(RAW 264.7)和肝細(xì)胞(HL 7702)作為細(xì)胞模型,采用粒子熒光標(biāo)記和活細(xì)胞成像技術(shù)開展細(xì)胞毒性效應(yīng)研究。

1 材料和方法

1.1 化學(xué)品和試劑

PP顆粒購自羅恩試劑公司,直徑約3 mm。尼羅紅和十二烷基磺酸鈉(SDS)購自Sigma公司。HL 7702和RAW 264.7細(xì)胞購自上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、5%胰蛋白酶購自Gibco。鏈霉素、青霉素、雙苯甲酰亞胺(Hoechst) 33258染色液、5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-碘化四乙基亞胺(JC-1)檢測試劑盒、2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自碧云天試劑公司。四氫呋喃(THF)和二甲亞砜(DMSO)購自濟(jì)昌納米公司。工作中使用超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.2 PP MPs/NPs的制備與表征

采用機(jī)械破碎法制備PP MPs/NPs[11-12]。將 40 g PP顆粒置于裝有200 mL SDS溶液(0.001%)的燒杯中。利用廚房攪拌機(jī)(Panasonic MX-G51,600 W)進(jìn)行機(jī)械破碎。攪拌機(jī)的工作方式設(shè)置為攪拌1 min,靜置7 min,24 h之后,將SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到0.003%,并在相同的工作模式下繼續(xù)工作24 h。靜置10 h后,用一次性注射器取出懸浮液?？紤]到不同粒徑顆粒的沉降速度不同,MPs/NPs分別通過1 000 r/min和14 000 r/min差速離心20 min獲得。MPs/NPs沉淀采用0.01% SDS溶液懸浮以保持良好的分散性。為了獲得準(zhǔn)確的樣品濃度,將MPs/NPs溶液分成兩等份;一半在真空干燥箱中40 ℃干燥24 h,干燥后的樣品用百萬分析天平稱重;另一半用0.01% SDS溶液稀釋至5 mg/mL,置于4 ℃?zhèn)溆靡赃M(jìn)行后續(xù)細(xì)胞暴露實(shí)驗(yàn)。

在S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM,Hitachi,Japan)上采集PP MPs/NPs的SEM圖像,并使用Nano Measurer軟件隨機(jī)分析PP MPs/NPs粒子。熒光成像通過Leica SP8共聚焦顯微鏡(CLSM,Leica,Germany)獲得。采用 Zetasizer NanoZS90(Malvern Instruments,UK)測量樣品的Zeta電位。

1.3 PP MPs/NPs的熒光標(biāo)記

PP MPs/NPs溶液(0.5 mg/mL,1 mL)與2 μL尼羅紅(5×10-4mol/L,溶于四氫呋喃)混合,振蕩孵育2 h。將混合物以14 000 r/min離心30 min并用超純水洗滌3次。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞攝取

將RAW 264.7和HL 7702細(xì)胞置于37 ℃空氣/CO2(95∶5)培養(yǎng)箱中,并使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在暴露實(shí)驗(yàn)中,采用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。RAW 264.7和HL 7702細(xì)胞接種24 h,尼羅紅標(biāo)記的PP MPs/NPs(80 μg/mL)與無血清培養(yǎng)基孵育1、3和6 h,采用CLSM成像(λex=405 nm,λem=410～460 nm;λex=594 nm,λem=600～650 nm),并通過Image J 軟件定量分析兩種細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度。

1.5 細(xì)胞毒性評估

采用MTT方法評估細(xì)胞毒性。將RAW 264.7和HL 7702細(xì)胞(密度為6×103個(gè)/細(xì)胞)進(jìn)行96孔細(xì)胞培養(yǎng)板鋪板。24 h后棄去培養(yǎng)基,將細(xì)胞與200 μL含有不同質(zhì)量濃度(20、50、80、100、150、200 μg/mL)PP MPs/NPs的無血清培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入MTT溶液(0.5 mg/mL,100 μL),繼續(xù)孵育4 h。最后加入150 μL DMSO溶解甲臜,用酶標(biāo)儀測定吸光度(λ=490 nm)。

1.6 細(xì)胞內(nèi)ROS水平測定

DCFH-DA探針用于檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。用含有PP MPs/NPs(80 μg/mL)的無血清培養(yǎng)基孵育RAW 264.7和HL 7702細(xì)胞24 h,收集細(xì)胞,預(yù)冷的PBS洗滌3遍。DCFH-DA探針染色20 min,采用FCM檢測細(xì)胞內(nèi)ROS,并進(jìn)行定量分析。

1.7 線粒體膜電位測量

JC-1法用于測定線粒體膜電位(MMP)的變化。用含有PP MPs/NPs(80 μg/mL)的無血清培養(yǎng)基孵育RAW 264.7和HL 7702細(xì)胞24 h,收集細(xì)胞,預(yù)冷的PBS洗滌3遍。采用JC-1工作液避光孵育20 min,30 min內(nèi)進(jìn)行FCM檢測和定量分析。

1.8 細(xì)胞凋亡

采用V-FITC/PI染色檢測細(xì)胞凋亡。用含有PP MPs/NPs(80 μg/mL)的無血清培養(yǎng)基孵育RAW 264.7和HL 7702細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞,預(yù)冷的PBS洗滌3遍。用Annexin V-FITC/PI避光孵育15 min,30 min內(nèi)進(jìn)行FCM檢測和定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 PP MPs/NPs的制備

如圖1(a)、(b)所示,通過對PP進(jìn)行機(jī)械破碎和差速離心分別獲得約1 μm的MPs顆粒和約200 nm的NPs顆粒,表示為PP MPs/NPs。PP MPs/NPs在水溶液中的Zeta電位分別為-23.6 mV和-28.2 mV,使其在水溶液中具有良好的分散性。兩種顆粒的形態(tài)都是不規(guī)則的,但粒徑分布在很小的范圍內(nèi)(圖1(c))。

圖1 PP MPs/NPs的SEM圖像與粒徑分布

2.2 細(xì)胞攝取

巨噬細(xì)胞在攝取外來顆粒和先天性免疫應(yīng)答中起重要作用,肝臟是異物顆粒蓄積的主要靶器官,因此本研究選擇RAW 264.7巨噬細(xì)胞和HL 7702肝細(xì)胞作為受試細(xì)胞。為了追蹤細(xì)胞攝取行為,將尼羅紅熒光標(biāo)記的PP粒子和細(xì)胞孵育,并采用CLSM成像進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。CLSM圖像顯示PP MPs/NPs在1 h內(nèi)被兩種細(xì)胞快速攝取(圖2(a)、(b)),并分布至細(xì)胞質(zhì)中。隨著孵育時(shí)間增加(3～6 h),攝取量逐漸增加。細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的定量分析表明,RAW 264.7細(xì)胞中內(nèi)化MPs/NPs的數(shù)量高于HL 7702細(xì)胞。此外,RAW 264.7細(xì)胞在MPs/NPs之間顯示出相似的攝取水平,而6 h時(shí)HL 7702細(xì)胞對NPs的攝取量明顯高于MPs(圖2(c)、(d))。

與對照組相比,*P<0.05;與MPs相比,#P<0.05)。

2.3 細(xì)胞毒性

通過MTT法評估PP MPs/NPs在兩種細(xì)胞中的細(xì)胞毒性。如圖3(a)和(b)所示,PP粒子的細(xì)胞毒性效應(yīng)表現(xiàn)出劑量、大小和細(xì)胞類型的依賴性。孵育24 h后,當(dāng)粒子質(zhì)量濃度高于50 μg/mL時(shí),細(xì)胞毒性隨著粒子暴露濃度增加而增加。在相同劑量下,粒子質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)NPs顯示出比MPs更高的細(xì)胞毒性。在最高測試質(zhì)量濃度下(200 μg/mL),對于RAW 264.7和HL 7702細(xì)胞,NPs的細(xì)胞活力降低了40%～50%,而MPs的值仍然保持在下降10%左右。此外,RAW 264.7細(xì)胞由于其特異性的細(xì)胞功能,其受影響程度低于HL 7702細(xì)胞?？赡芤?yàn)镽AW 264.7作為一種吞噬細(xì)胞,負(fù)責(zé)殺滅病原菌等外來顆粒,同時(shí)分泌抗體中和有害物質(zhì),具有較高的毒性耐受性。

與對照組相比，*P<0.05;與MPs相比，#P<0.05;與不同劑量相比，@P < 0.05;與RAW 264.7相比，&P < 0.05。

ROS水平被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的主要原因[13]。此外,ROS水平也被證明是納米材料的重要毒理學(xué)指標(biāo)。采用DCFH-DA熒光探針檢測PP MPs/NPs(80 μg/mL)誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS含量。圖3(c)—(e)顯示PP NPs對HL7702細(xì)胞誘導(dǎo)的ROS水平高于MPs,這可能是由于更快的內(nèi)化速率和更高的積累量;此外,較小的尺寸和較大的比表面積使NPs易于與細(xì)胞內(nèi)大分子和亞細(xì)胞器相互作用,從而導(dǎo)致更多的ROS形成。相反地,RAW264.7的胞內(nèi)ROS水平不呈粒徑依賴性,可能與其對MPs/NPs具有相似的細(xì)胞攝取量有關(guān)。與RAW 264.7細(xì)胞相比,處理后的HL 7702細(xì)胞ROS水平顯著升高,這一現(xiàn)象與MTT結(jié)果一致[14]。

2.4 介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的線粒體相關(guān)通路

細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加誘導(dǎo)線粒體膜電位下降,進(jìn)而導(dǎo)致線粒體損傷[15]。采用JC-1法檢測PP MPs/NPs對線粒體功能的影響。FCM結(jié)果觀察到對照組細(xì)胞具有良好的極性,而PP MPs/NPs(80 μg/mL)處理的RAW 264.7和HL 7702細(xì)胞的細(xì)胞群明顯下移(圖4(a)、(b)),暗示MPs/NPs能夠明顯降低兩種細(xì)胞的線粒體膜電位。MPs/NPs染毒的RAW 264.7細(xì)胞紅綠熒光比(JC-1聚合體/JC-1單體比)分別降低了47.0%和68.2%,對于HL 7702細(xì)胞分別降低了53.1%和75.9%(圖4(c))。結(jié)果表明MPs/NPs均可降低兩種細(xì)胞的線粒體膜電位并表現(xiàn)出粒徑差異效應(yīng),而兩種類型的細(xì)胞之間的差異不大。

與對照組相比，*P<0.05;與MPs組相比，#P<0.05。

細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位降低導(dǎo)致線粒體功能受損,ATP水平下降,進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡[16]。因此,采用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。如圖5(a)和(b)所示,PP MPs/NPs均能誘導(dǎo)RAW264.7和HL7702細(xì)胞發(fā)生凋亡,并表現(xiàn)出細(xì)胞類型依賴性。PP MPs/NPs暴露處理24 h后,RAW 264.7細(xì)胞凋亡率分別為19.7% 和 36.2%，HL 7702細(xì)胞凋亡率分別為23.7% 和 42.0%(圖5(c))。PP MPs/NPs 誘導(dǎo)顯著的粒徑依賴性細(xì)胞凋亡,這與線粒體膜電位的變化趨勢一致,暗示PP MPs/NPs可能通過線粒體相關(guān)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

與對照組相比，*P<0.05;與MPs組相比，#P<0.05;與RAW 264.7相比,&P < 0.05。

3 討 論

微/納塑料相關(guān)研究已成為熱點(diǎn),其中聚苯乙烯微/納塑料(PS MPs/NPs)易通過化學(xué)聚合反應(yīng)合成或容易購得商品化的模型粒子,故大多數(shù)MPs/NPs毒性研究主要采用PS為研究對象[17]。實(shí)驗(yàn)室合成的顆粒通常表現(xiàn)出均一規(guī)則的球形形貌、精確可控的粒徑和表面化學(xué)性質(zhì),與現(xiàn)實(shí)環(huán)境中MPs/NPs存在著很大差異。因此從該模型顆粒獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并不能反映真實(shí)生物學(xué)效應(yīng)。同時(shí)MPs/NPs是復(fù)合概念,塑料材質(zhì)也影響其毒性效應(yīng),研究聚焦于PS MPs/NPs不能代表其他聚合物類型。由于PP本身的物化特性,微/納模型粒子難以通過化學(xué)合成制備。已有工作采用固體研磨/篩分方法,僅能獲得20 μm到200 μm的大粒徑MPs[14,18-19]。普遍認(rèn)為,NPs較MPs具有更強(qiáng)的生物屏障穿透能力和更高的化學(xué)反應(yīng)性[20],但由于PP NPs模型粒子的缺乏,其真實(shí)的毒性效應(yīng)也尚未得到評估。因此,本研究采用料理機(jī)打磨和差速離心方法,制備了PP MPs/NPs模型粒子。

MPs/NPs的粒徑明顯影響其生物攝取、清除、體內(nèi)分布和毒性。相比大粒徑MPs,小粒徑NPs更容易穿過生物屏障,誘導(dǎo)更嚴(yán)重的毒性反應(yīng)。因此考察了粒徑對于細(xì)胞攝取效率和細(xì)胞毒性的影響。RAW 264.7細(xì)胞對PP顆粒的攝取沒有表現(xiàn)出粒徑相關(guān)性,但相比于PP MPs,NPs表現(xiàn)出更高的生物學(xué)毒性。對于HL 7702細(xì)胞,PP NPs比PP MPs表現(xiàn)出更高的蓄積水平、細(xì)胞毒性和ROS含量。與RAW 264.7細(xì)胞不同的是,HL 7702細(xì)胞作為非吞噬細(xì)胞更傾向于攝取納米級塑料顆粒,這可能是相比于MPs,NPs可采用更多的內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)行胞內(nèi)攝取[21],如網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白相關(guān)的內(nèi)吞機(jī)制。在RAW 264.7細(xì)胞和HL 7702細(xì)胞中,PP NPs 比 PP MPs 表現(xiàn)出更高的線粒體損傷和細(xì)胞凋亡,這可能是因?yàn)镹Ps更容易與細(xì)胞內(nèi)大分子和亞細(xì)胞器相互作用,導(dǎo)致更高的生物學(xué)效應(yīng)[20]。

細(xì)胞類型被認(rèn)為是影響納米顆粒與細(xì)胞相互作用的重要因素。結(jié)果顯示PP MPs/NPs與細(xì)胞相互作用依賴于細(xì)胞類型,RAW 264.7比HL 7702表現(xiàn)出更高的細(xì)胞攝取和毒性耐受性。在體內(nèi)研究中,納米顆粒在血循環(huán)中主要被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞清除。也有少部分的納米顆粒避開了網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的識別,轉(zhuǎn)運(yùn)到次級器官并與組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞相互作用。由于MPs/NPs優(yōu)先在肝臟中積累,且肝細(xì)胞承擔(dān)了肝臟的大部分代謝功能。因此采用RAW 264.7巨噬細(xì)胞和HL 7702肝細(xì)胞,考察細(xì)胞類型對于MPs/NPs攝取和細(xì)胞毒性的影響。PP MPs/NPs在RAW 264.7細(xì)胞中的攝取量比HL 7702細(xì)胞大約高2倍,而PP MPs/NPs在RAW 264.7細(xì)胞中的細(xì)胞毒性則低于HL 7702細(xì)胞。PP MPs/NPs處理后,RAW 264.7和HL 7702細(xì)胞中ROS水平均升高。粒徑對RAW 264.7細(xì)胞ROS水平影響不大,而NPs導(dǎo)致HL 7702細(xì)胞中ROS水平顯著升高。

不同細(xì)胞的毒性差異可能與細(xì)胞功能有關(guān)。一方面吞噬細(xì)胞能夠有效地?cái)z取外來顆粒,及時(shí)將其從體內(nèi)清除；另一方面,吞噬細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)最重要的組成細(xì)胞,可激活免疫應(yīng)答,分泌多種細(xì)胞因子和特異性抗體,從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性。細(xì)胞內(nèi)ROS的增加進(jìn)一步誘導(dǎo)線粒體膜電位下降和細(xì)胞凋亡。盡管PP MPs/NPs在兩類細(xì)胞間線粒體膜電位差異不大,但在細(xì)胞凋亡方面卻表現(xiàn)出明顯差異,在HL 7702細(xì)胞中表現(xiàn)出更高的凋亡率,提示除了線粒體介導(dǎo)的機(jī)制外,還可能存在其他機(jī)制介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。據(jù)報(bào)道,溶酶體膜通透性增加導(dǎo)致水解酶釋放到細(xì)胞質(zhì)中以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可以介導(dǎo)促凋亡和抗凋亡分子的表達(dá),這兩種機(jī)制均可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡[22-23]。后續(xù)我們將對這兩種作用機(jī)制進(jìn)行考察,來進(jìn)一步完善PP MPs/NPs致細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究采用機(jī)械破碎和差速離心方法制備PP MPs/NPs,考察了其對RAW 264.7和HL 7702細(xì)胞的毒性效應(yīng)和機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PP MPs/NPs在細(xì)胞內(nèi)的累積,引發(fā)顆粒尺寸和細(xì)胞類型相關(guān)的毒性效應(yīng)，毒理機(jī)制與誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而引發(fā)線粒體損傷和細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究為PP MPs/NPs的毒理學(xué)效應(yīng)提供了基礎(chǔ)信息,提示應(yīng)對塑料粒子引發(fā)的人體健康風(fēng)險(xiǎn)予以關(guān)注。