連靈燕，趙 慧，王國英，王建華，孫世賢

（1.長治市潞州區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山西 長治 046000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院種子科學(xué)系，北京 100193；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081；4.全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，北京 100125）

DNA指紋圖譜是根據(jù)每個(gè)品種的DNA組成，為其建立的可見的條碼式譜帶圖譜。它提供的證據(jù)是品種的基因型，是穩(wěn)定的DNA帶譜，不受栽培條件影響，并可通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行系統(tǒng)管理。DNA指紋圖譜技術(shù)可對植物基因做出明確的鑒定，特別是對那些沒有準(zhǔn)確系譜記載的育種材料進(jìn)行遺傳分類，彌補(bǔ)系譜記載的缺失；育種人員可以采用這項(xiàng)技術(shù)鑒定自交系的遺傳特征，保護(hù)這些自交系的品種權(quán)免受侵犯。因此，研究玉米自交系的指紋圖譜具有重要意義。

本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建20個(gè)玉米自交系的指紋圖譜，以期找出其特征譜帶，以便進(jìn)一步利用并發(fā)揮其優(yōu)勢。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本研究所用的材料包括20份玉米自交系，其中昌7-2、P138、478、HC、Mo17、Sh15、鄭58、B73、丹598、9058為育種中常用的優(yōu)良自交系，HCL2、HCL4、HCL5、P1、紫58、P2、J53、L50、Y1382、Y1281為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院種子科學(xué)系近年選育的優(yōu)良自交系。

表1 20個(gè)玉米自交系的編號及名稱Tab.1 The number and name of 20 maize inbred lines

1.2 SSR分析

1.2.1 基因組DNA提取

采用改進(jìn)的CTAB法提取葉片總DNA，用紫外可見分光光度計(jì)檢測DNA的濃度，將DNA樣品稀釋至10 ng/μL備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增所需SSR引物由上海生工合成，溶解后置于-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

反應(yīng)體系：每20μL體積中含1×EasyTaq Buffer，0.4 mmol/L dNTP Mix，SSR引 物(正 向 引 物 和 反 向 引 物)各0.25μmnol/L，1U EasyTaq DNA聚合酶，20 ng DNA模板，反應(yīng)液上加蓋一滴礦物油，于ABI 9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸40 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸7 min。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1/6體積的Loading Buffer，用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。緩沖液為1×TBE，400V電壓電泳2 h，銀染顯影。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.3.1 指紋圖譜數(shù)字化

讀取SSR標(biāo)記，將SSR帶型轉(zhuǎn)換為0、1、2數(shù)據(jù)，在相同遷移率位置，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“2”，建立數(shù)字指紋數(shù)據(jù)庫。

1.3.2 SSR引物的多態(tài)性信息量分析

多態(tài)性信息量（Polymorphism Information Content，PIC）是指一個(gè)標(biāo)記依靠其可檢測的等位基因數(shù)和它們的分布頻率，從而得到該標(biāo)記在一個(gè)群體中檢測的多態(tài)性大小值。PIC值按照Anderson等[1]的方法計(jì)算，對于標(biāo)記i的PIC值計(jì)算公式為：

式中：Pij——標(biāo)記i的第j個(gè)帶型出現(xiàn)的頻率，標(biāo)記i的總帶型從1～n。PIC值的大小為0～1，0——無多態(tài)性，l——具有非常高的多態(tài)性（Anderson et al，1993）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選及其多態(tài)性

本研究依據(jù)MaizeGDB（http://www.maizegdb.org/）上提供的資料，初步選擇了225對SSR引物。引物的選取原則是在染色體上均勻分布。根據(jù)225對SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果，最終選取帶型清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性高的21對引物作為構(gòu)建指紋圖譜的核心引物，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。21對SSR引物均勻分布于玉米10條染色體上，在20個(gè)玉米自交系共檢測出105個(gè)等位變異，引物等位位點(diǎn)數(shù)在3～10個(gè)，平均每對引物檢測出5.0個(gè)等位變異。引物等位位點(diǎn)多態(tài)性信息含量PIC變幅為0.460～0.780，平 均0.643。其 中 以 引 物umc2164值 最 高（0.780），引物umc1072值最低（0.460）。從表2還可看出，SSR多態(tài)性信息含量與等位變異數(shù)不盡一致。

表2 SSR引物序列及其擴(kuò)增的多態(tài)性帶數(shù)Tab.2 The SSR primer sequence and the number of polymorphic bands amplified

2.2 DNA指紋圖譜的構(gòu)建

根據(jù)擴(kuò)增的帶型，選出在大部分材料中都僅擴(kuò)增出一條譜帶，且多態(tài)性、重復(fù)性好，能區(qū)分所有供試材料的引物，用于構(gòu)建本試驗(yàn)的20個(gè)玉米自交系的指紋圖譜。其中有umc1038、bnlg2047、umc2323、umc2164、umc1432、umc1072、umc1037、phi308707、umc1185等9對引物組合可以將供試材料分開；引物umc1037對材料1有特征譜帶；引物umc1185對材料7有特征譜帶；引物umc2323對材料12有特征譜帶；引物bnlg2047對材料5，13，20有特征譜帶；引物umc2164對材料10、16、18有特征譜帶；umc1072與phi308707組合區(qū)分材料2、3、4；其余材料可由引物bnlg2047、umc2164、umc1432、umc1072、umc1037、phi308707與phi116的組合來區(qū)分。

趙久然等[3]提出當(dāng)引物對的等位基因數(shù)為N時(shí)，理論上該引物可區(qū)分的最大自交系的數(shù)為N。本研究確定的一套21個(gè)核心引物組合可區(qū)分的最大自交系數(shù)N=1.79×1014，且得到相同指紋圖譜的概率P=5.6×10-15。因此，用這套引物來構(gòu)建20個(gè)玉米自交系的指紋圖譜是完全可行的。將篩選到的21對引物所擴(kuò)增的條帶出現(xiàn)與否進(jìn)行記錄，將DNA指紋轉(zhuǎn)換成由1和0組成數(shù)值，完成指紋圖譜的數(shù)字化，見表3。

表3 用引物umc2164建立的20個(gè)玉米自交系的數(shù)字指紋Tab.3 The digital fingerprints of 20 maize inbred lines established with primer umc2164

3 結(jié)果與討論

3.1 玉米自交系SSR指紋圖譜的構(gòu)建與應(yīng)用

指紋圖譜的建立可為自交系材料的保護(hù)提供重要依據(jù)。此外，指紋圖譜的遺傳距離、親緣關(guān)系分析同樣是對指紋圖譜的重要應(yīng)用，其分析結(jié)果可以幫助育種家較為準(zhǔn)確地進(jìn)行種質(zhì)資源的血緣類群劃分以及雜種優(yōu)勢的預(yù)測，減少了育種的盲目性。

利用SSR技術(shù)建立指紋圖譜除了結(jié)果可靠、應(yīng)用廣泛的優(yōu)越性外，也存在一定的局限性。如：改良品種與被改良品種的雙親血緣關(guān)系極為相近，難以利用SSR標(biāo)記將其全部區(qū)分。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因主要是SSR標(biāo)記與基因連鎖不緊密或與SSR標(biāo)記連鎖的基因并不完全表達(dá)。所以，在構(gòu)建玉米DNA指紋圖譜時(shí)對于差異小的品種如改良品種和轉(zhuǎn)基因品種，應(yīng)增加引物數(shù)量，且最好在每條染色上均勻分布。

3.2 核心引物的選取

在選取核心引物時(shí)，多態(tài)性信息量是重要的選擇條件，但同時(shí)還應(yīng)充分考慮引物對的整體的區(qū)分效果,盡可能反映出基因組的差異。多態(tài)性信息量高說明其擴(kuò)增產(chǎn)物的多樣性好，能區(qū)分較多的供試材料，從而用較少的引物就可以將供試材料分開；對于少數(shù)特殊的材料（不易找出特征譜帶或不易區(qū)分），只有個(gè)別PIC值較低的引物，對其有特征性譜帶或與其他引物組合才能將其區(qū)分開，為了便于區(qū)分供試材料也應(yīng)保留這些引物，如：本實(shí)驗(yàn)中引物umc1072、umc1185雖然它的PIC值低于0.5，但由于umc1185對材料7有特征性譜帶，umc1072與引物與phi308707組合能區(qū)分親緣關(guān)系較近的材料HCL2、HCL4、HCL5。