崔芙蓉，王升厚，李夢雪，柳葉飛，徐方旭*

（1.沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽 110034；2.沈陽師范大學(xué)實驗教學(xué)中心，遼寧沈陽 110034）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）是一種藥食同源真菌，含有蟲草素、蟲草酸及蟲草多糖等活性成分[1-2]。在蛹蟲草栽培過程中，白毛病危害較為嚴(yán)重，極易造成蛹蟲草子實體倒伏和矮小畸形。植物生長調(diào)節(jié)劑是人工合成或天然提取的具有激素生理活性的化合物，目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，并取得了顯著效果。本實驗對蛹蟲草栽培過程中感染的病原真菌進行分離純化及鑒定，通過侵染實驗探究植物生長調(diào)節(jié)劑GN-01對蛹蟲草寄生性病原真菌的誘導(dǎo)抗病作用，旨在為白毛病的控制及預(yù)防提供理論依據(jù)[3]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

不同區(qū)域發(fā)病的蛹蟲草、蛹蟲草菌株P(guān)T07（沈陽師范大學(xué)特種菌業(yè)研究所提供）、植物生長調(diào)節(jié)劑（GN-01）、真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖水（Potato Dextrose Broth，PDB）培養(yǎng)基[4]。

1.2 實驗方法

1.2.1 病原真菌分離純化

刮取發(fā)病蛹蟲草上的病原真菌菌絲，采用劃線法將其接種于PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～7 d；待有菌落形成時，挑取單個菌落，用點接法將其接種至PDA 培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。重復(fù)上述操作，直到純化出單一菌落，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹5]。

1.2.2 病原真菌形態(tài)鑒定

將純化后的病原真菌接種于PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃條件下培養(yǎng)至生長出完整的菌落，觀察菌落形態(tài)特征。利用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲和孢子的形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊》進行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.3 病原真菌分子生物學(xué)鑒定

將純化后的病原真菌接種于PDA 斜面上，樣品送至上海派諾森生物科技有限公司進行真菌基因組DNA提取、真菌基因組PCR 擴增、PCR 產(chǎn)物的回收及DNA序列的對比分析。將所得序列文件與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 病原真菌侵染蛹蟲草子實體

GN-01 稀釋濃度（均為體積濃度）分別為1∶50（2 號）、1∶100（3 號）、1∶200（4 號）、1∶500（5號）、1∶1 000（6 號）、1∶3 000（7 號）、1∶3 500（8 號）和1∶4 000（9 號），對照組（1 號）為清水。分別在蛹蟲草栽培培養(yǎng)基中和生長過程中加入不同稀釋濃度的GN-01，并按照蛹蟲草常規(guī)方法進行培養(yǎng)。

將分離所得病原真菌接種于PDB 培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)7 d，將菌體打碎，用無菌水稀釋100 倍備用。選擇生長到第35 d 的、2 種不同培養(yǎng)方式的蛹蟲草子實體進行病原菌侵染實驗，對照組補等量清水，在20 ℃培養(yǎng)55 d后測定防御酶活性及發(fā)病率。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 SOD和POD酶活性測定

SOD 和POD 酶活性測定的藥品配制及實驗步驟參照文獻[6]的方法進行。

1.3.2 發(fā)病率測定

按照公式（1）計算不同實驗組別蛹蟲草總發(fā)病率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原真菌形態(tài)鑒定

分離所得病原真菌分別命名為BYJ1 和BYJ2。如圖1 所示，2 種病原真菌在PDA 培養(yǎng)基中生長3～7 d后，菌絲部分為白色，不透明，菌絲致密，邊緣規(guī)則；菌落顏色正反一致，生長速度較慢；菌絲分枝，有隔；有明顯成熟脫落的孢子且孢子較小，孢子直徑為3.8～4.5 μm。BYJ1 菌株菌絲寬度為2.0～5.0 μm，BYJ2菌株菌絲寬度為5.0～6.3 μm。

圖1 白毛病病原菌菌落形態(tài)

2.2 病原真菌的分子鑒定

將病原菌BYJ1 和BYJ2 所得序列進行拼接后與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的序列數(shù)據(jù)進行比對。由圖2 可知，BYJ1 為日耳曼曲霉（Aspergillus germanicus），BYJ2 為焦曲霉（Aspergillus ustus）。

圖2 白毛病菌株鑒定系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 GN-01對蛹蟲草抗病能力的影響

2.3.1 GN-01對蛹蟲草防御氧化酶活性的影響

隨著在栽培培養(yǎng)基中添加或在生長過程中補加GN-01 稀釋倍數(shù)的增大，蛹蟲草子實體的SOD 和POD酶活性呈先增強后降低的趨勢，在稀釋倍數(shù)為3 000時（7 號樣品）防御氧化酶活性最高，說明蛹蟲草子實體在受到病原真菌侵害時，適當(dāng)濃度的GN-01 可誘導(dǎo)SOD 和POD 酶活性明顯上升，以抵抗病原真菌侵害（見圖3、圖4）。

圖3 不同濃度GN-01對蛹蟲草SOD活性的影響

圖4 不同濃度GN-01對蛹蟲草POD活性的影響

2.3.2 GN-01對蛹蟲草發(fā)病率的影響

由表1 可知，在培養(yǎng)基中添加或在生長過程中補加稀釋50～4 000 倍的GN-01，蛹蟲草白毛病發(fā)病率呈逐漸降低趨勢。這說明蛹蟲草受到病原真菌侵害時，在栽培培養(yǎng)基中添加或在生長過程中補加稀釋50～4 000 倍的GN-01 可顯著減輕病原真菌的侵害，提高蛹蟲草的抗病性。

表1 不同GN-01濃度下蛹蟲草白毛病發(fā)病率

2.4 侵染實驗

根據(jù)前述預(yù)實驗結(jié)果，選擇稀釋3 000 倍的GN-01 進行病原真菌侵染抗性實驗。如圖5 所示，與對照組相比，在栽培培養(yǎng)基中添加和在生長過程中補加稀釋3 000 倍的GN-01，蛹蟲草子實體的發(fā)病程度均呈著減輕，與前述的預(yù)實驗結(jié)果相吻合。

圖5 不同處理方式蛹蟲草白毛病發(fā)病情況比較

3 討論與結(jié)論

植物誘導(dǎo)抗病性被認(rèn)為是植物保護技術(shù)的新途徑。蛹蟲草自身具有一套完整的防御體系，生物或非生物脅迫都可刺激這種防御反應(yīng)，因此通常將防御酶活性變化作為衡量植株防御能力的重要指標(biāo)。SOD可清除自由基，延緩植物衰老；POD 可減少活性氧積累，保護膜結(jié)構(gòu)完整。本實驗以在蛹蟲草培養(yǎng)基添加GN-01 和在生長過程中補加GN-012 種實驗所得的蛹蟲草子實體為原材料，對蛹蟲草的防御酶活性進行測定，以探究GN-01 對蛹蟲草的誘導(dǎo)抗病性作用。結(jié)果表明，當(dāng)蛹蟲草受到病原真菌侵害時，在栽培培養(yǎng)基中添加或在生長過程中補加稀釋50～3 000 倍的GN-01 時，SOD 和POD 酶活性呈上升趨勢，且在GN-01稀釋倍數(shù)為3 000時，SOD 和POD 酶活性達到峰值，能有效減輕病原真菌的侵害，提升蛹蟲草的抗病性，侵染實驗結(jié)果與酶活性實驗結(jié)果吻合。

將植物生長調(diào)節(jié)劑作為病原菌抑制劑進行開發(fā)有較好的應(yīng)用前景，在栽培培養(yǎng)基中添加或在生長過程中補加稀釋3 000 倍的GN-01，都可提高蛹蟲草相關(guān)防御酶活性，有效防治蛹蟲草寄生性病原真菌病害的發(fā)生。目前，蛹蟲草寄生性病原真菌研究體系還不完整，大部分的致病機制有待深入研究，未來應(yīng)著重研究病原菌致病機制和篩選蛹蟲草優(yōu)良抗病菌株。