張敏

廣東省食品檢驗所（廣東省酒類檢測中心）（廣州 510435）

隨著人們生活水平提高，保健食品作為一類具有保健功能的特殊食品，也越來越受到市場歡迎。在保健食品如片劑類、膠囊劑類產品的生產過程中，通常會添加莧菜紅、誘惑紅等色素以改善產品外觀。莧菜紅是一種常見的食品用人工合成著色劑，又稱食品用色素紅色素2號、C.I.酸性紅27、C.I.16185、FD及C紅2號、3-羥基-4-[（4-磺酸基-1-萘基）偶氮基]-2, 7-萘二磺酸三鈉鹽，屬于偶氮酸性水溶性染料[1]，同其他人工合成色素如檸檬黃、胭脂紅一樣，其色澤鮮艷、性質穩(wěn)定、著色力強，被廣泛應用于食品、保健食品、藥品、化妝品等的著色，起到改善產品色澤、增加美觀性、增進食欲等效果[2]。然而，人工合成食品色素多由煤焦油、苯、萘等芳香化合物為原料制成。莧菜紅作為一種偶氮化合物，會在體內經代謝生成β-萘胺和α-氨基-1-萘酚等具有強烈致癌性的物質[3]，若過量攝入會在體內蓄積，對腎臟、肝臟產生一定傷害。近年來，市場監(jiān)管部門一直把該類著色劑納入監(jiān)管范圍，因此，對莧菜紅的檢測及確保結果準確顯得尤為必要。

不確定度是指由于測量誤差的存在，對被測量值的不能肯定的程度。它是測量結果質量的指標，會直接影響檢驗結果。測量結果的不確定度可以提高檢測結果的可靠性。另外，不確定度評定也可以判定測量結果質量的高低，影響判定檢驗結果的合格與否[4-6]。參照GB 5009.35—2016《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》[7]，采用高效液相色譜法測定保健食品（片劑類）中的莧菜紅含量，對測量結果進行不確定度評定。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

莧菜紅標準溶液（壇墨公司，500 μg/mL，相對擴展不確定度Ur=3%，k=2）；甲醇（色譜純，德國默克公司）；乙酸銨（色譜純，FISHER公司）；無水乙醇（分析純，廣試公司）；甲酸（分析純，光華公司）；氨水（分析純，光華公司）；聚酰胺粉（0.075 0～0.150 mm孔徑，即100～200目，國藥試劑公司）。

1.2 主要儀器與設備

高效液相色譜儀（Acquity Arc配有二極管陣列檢測器及empower數據處理軟件，美國沃特世公司）；電子天平（ME203，瑞士梅特勒-托利多公司）；可調移液器（J11005G，10～100 μL及L42224G，100～ 1 000 μL，德國艾本德公司）；超純水系統（Milli-Q Reference，德國密理博公司）；旋轉蒸發(fā)儀（配有冷卻循環(huán)系統，德國IKA公司）；離心機（ST8，美國賽默飛世爾公司）；單線標容量瓶（10 mL和5 mL，均為A級，博美公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 標準溶液配制

分別吸取0.01，0.02，0.10，0.20，0.40和1.00 mL莧菜紅標準溶液（500 μg/mL），用一級水定容至10 mL，配制成質量濃度0.5，1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL的系列標液，上機測定，繪制峰面積-莧菜紅溶液濃度標準曲線。

1.3.2 測定方法

稱取10 g左右粉碎樣品，放入100 mL小燒杯中，加水30 mL，溫熱溶解，用檸檬酸溶液調至pH 6左右。樣品溶液加熱至60 ℃，將1 g聚酰胺粉加少許水調成粥狀，倒入樣品溶液中，攪拌片刻，以G3垂融漏斗抽濾，用60 ℃ pH 4的水洗滌3～5次，用甲醇-甲酸混合溶液洗滌3～5次，用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，直至色素完全解吸，收集解吸液，水浴旋轉蒸發(fā)至近干，加水溶解，定容至5 mL。經0.45 μm微孔濾膜過濾，進高效液相色譜儀分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱采用賽默飛Acquasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為甲醇，流動相B為乙酸銨溶液（0.02 mol/L）；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。梯度程序：A，15% 1.0 min，15%～60% 2.0 min，60%～80% 2.0 min，80%～15% 1.5 min，15% 5.5 min。

1.3.4 數學模型

樣品中莧菜紅含量X按式（1）計算。

式中：X為樣品中莧菜紅含量，mg/kg；C為樣品待測液中莧菜紅質量濃度，μg/mL；V為最終定容體積，mL；m為樣品的稱樣量，g；1 000為換算系數。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

不確定度來源用因果圖表示，見圖1。

圖1 X的不確定度來源因果圖

2.2 不確定度評定

2.2.1 評定標準溶液配制過程引入的不確定度

2.2.1.1 標準溶液引入的相對不確定度評定

莧菜紅標準溶液（500 μg/mL，購自壇墨公司），查標準物質證書，可知由莧菜紅標準溶液引入的相對不確定度urel(C)為urel(C)=uC/C=7.5/500=0.015 0。

2.2.1.2 標準溶液稀釋過程引入的相對不確定度評定

由1.3.1的標準溶液配制可知，標準溶液稀釋定容過程中使用到100～1 000 μL可調移液器移取200，400和1 000 μL的體積，使用到10～100 μL可調移液器分別移取10，20和100 μL的體積，分別用10 mL單線標容量瓶定容。查檢定證書可得，可調移液器的容量測量結果不確定度見表1，則100～1 000 μL可調移液器移取200，400和1 000 μL的容量允差相對標準不確定度分別為0.004/2=0.002，0.002/2=0.001和0.002/2=0.001；10～100 μL可調移液器移取10，20和100 μL的容量允差相對標準不確定度分別為0.020/2=0.010，0.020/2=0.010和0.004/2=0.002。

表1 可調移液器容量測量結果相對擴展不確定度

根據JJG 196—2006《常用玻璃量器》[8]，10 mL A級容量瓶在20 ℃的最大容量允差為±0.020 mL，按均勻分布（k=3），10 mL容量瓶容量允差的相對標準不確定度為

實驗室溫度波動范圍為（20±5）℃，水的體積膨脹系數為0.000 21 ℃-1，按均勻分布（k=3），環(huán)境溫度變化的相對標準不確定度為urel(T)=

由不確定度分量可得，標準溶液稀釋過程引入的合成相對標準不確定度為

2.2.2 評定標準曲線擬合引入的不確定度

采用外標法對6個不同濃度的莧菜紅標準系列溶液進行測定，上機測得相應的峰面積，見表2，以最小二乘法擬合，得到莧菜紅標準物質濃度x和峰面積y的線性方程和相關系數?；貧w方程為y=bx+a，其中b=23 161.28，a=1 643.933，相關系數r=0.999 989。

表2 莧菜紅標準系列溶液測定結果

樣品待測液用高效液相色譜儀測定，得2份平行試樣積分峰面積，并計算樣品中莧菜紅含量，由X1與X2取均值，測得值為X，結果見表3。

表3 2份平行試樣積分峰面積及含量測定結果

按照JJF 1035—2005《化學分析測量不確定度評定》[9]計算標準曲線的殘差標準差SR，結果為

標準曲線引入的相對標準不確定度urel(Q)為

式中：n為標準系列溶液的總測量次數（n=6）；P為樣品重復測定次數（P=2）；c為樣品用該擬合曲線測定2次的濃度平均值；為標準系列溶液的平均濃度（=14.417 μg/mL）。

2.2.3 評定樣品稱量引入的相對不確定度

稱量樣品時天平室與干燥器為相同濕度，稱量時無吸潮。查JJG 1036—2008《電子天平》[10]得，試驗中使用量程最大允許誤差的絕對值M P E V= 0.5e=0.005 g，按照均勻分布（k=3）計算，樣品稱樣量平均值為10.053 g，則稱量樣品質量時由天平最大允許誤差引入的樣品質量的相對標準不確定度為

2.2.4 評定樣液定容引入的不確定度

u(V)由5 mL單線標容量瓶引入，主要由允許誤差u允差(V)和溫差u溫差(V)線性疊加而得。

查JJG 196—2006得，5 mL A級單標線容量瓶的允差為±0.020 mL，按三角分布估算，標準不確定度為

實驗室溫度為25 ℃，容量瓶校準時溫度為20 ℃，由于液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，可只考慮液體的體積膨脹，認為供試液的體積膨脹系數與水近似，水的體積膨脹系數為0.000 21 ℃-1，因此產生的體積變化半寬為5 mL×0.000 21 ℃-1×5 ℃=0.005 25 mL，按操作規(guī)程，體脹系數不作修正，此處按不確定度處理，假設溫度變化為矩形分布，則

由樣液定容引起的相對標準不確定度為ur(V)=

2.2.5 評定樣品測量重復性引入的不確定度

試驗進行6次重復測量，結果見表4。

表4 樣品中莧菜紅含量的重復測量數據表

則測量重復性引入的相對標準不確定度為urel(R)=

2.2.6 評定加標回收率引入的不確定度

在樣品中加入適量目標分析物進行3個水平（1.00，5.00和20.0 mg/kg）加標回收試驗，每個水平平行測定2次，計算平均加標回收率及標準偏差。對回收率結果進行顯著性檢驗（t檢驗），在95%置信區(qū)間，自由度為5時，t分布臨界值t0.95(5)=2.57，即當檢驗值t≥2.57時，樣品測量結果與回收率有顯著性差異，需使用回收率修正，反之則無需修正。結果見表5。

加標回收率引入的相對標準不確定度和t值分別按式（3）和（4）計算。

由表5可知，t＜t0.95(5)，與回收率100%之間無顯著性差異，故無需修正結果。

表5 加標回收率結果及相對標準不確定度

2.3 計算合成標準不確定度

樣品中的莧菜紅含量測定的不確定度分量見表6。

表6 樣品中的莧菜紅含量測定不確定度分量

對各不確定度分量進行合成計算，則試驗的合成相對標準不確定度為urel(x)=0.028 6 。

合成標準不確定度為u(x)=X×urel(x)=5.70×0.028 6=0.163 mg/kg。

2.4 評定擴展不確定度

按照JJF 1135—2005和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[11]的要求，一般測量可以取k=2，則樣品中的莧菜紅含量測定的擴展不確定度為U=u(x)×k=0.163×2=0.326 mg/kg。擴展不確定度有效位數最多為2位，且給定的測量結果位數和不確定度位數應一致，修約一般采用只進不舍的原則，則測量保健食品中莧菜紅含量的結果為5.70±0.33 mg/kg，k=2，相對擴展不確定度為Ur=5.8%。

3 結論

采用高效液相色譜法測定保健食品（片劑類）中莧菜紅含量，進行不確定度評定，分析6種不確定度來源并計算各分量，由結果可知，各測量不確定度分量中標準溶液配制影響最大，其次為加標回收率，接著是標準曲線擬合及樣品測量重復性，樣液定容和樣品稱量的影響最小。

標準溶液配制引入的不確定度主要來源于標物本身及稀釋過程，可考慮更換純標準品，或標準溶液稀釋時增加配制體積；樣品處理過程相對復雜，需經過提取、凈化、富集、濃縮、復溶等步驟，聚酰胺粉的產品質量亦會影響目標物的洗脫效果，導致回收率波動較大，從而影響測量結果不確定度，可進一步優(yōu)化前處理方法，如增加樣品提取次數、使用聚酰胺固相萃取小柱替代聚酰胺粉等，以提高回收率。此外，還可通過增加標準系列工作溶液的測量次數及樣品重復測量次數等手段減少測量過程中的不確定度，保證結果準確性。