高江濤，梁馨文，張凱旋，劉建偉，邵明亮

西安諾眾康健生物科技有限責(zé)任公司（西安 710000）

隨著社會大眾健康意識的覺醒，腸道內(nèi)定殖的以1013～1014計的腸道菌群獲得全球?qū)W術(shù)界和廣大消費(fèi)者極大的關(guān)注。學(xué)術(shù)界從認(rèn)識普及腸道是人最大的免疫器官，到不斷發(fā)表的“腦-腸軸”、“肝-腸軸”、“腎-腸軸”等模型研究，以及不斷報道的腸道菌群與壽命、腸道菌群與肥胖關(guān)系、腸道菌群與糖尿病關(guān)系、腸道菌群與老年癡呆等病理的發(fā)現(xiàn)，越來越深入的研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群幾乎與身體健康密不可分，調(diào)節(jié)腸道菌群來改善身體健康已成為研發(fā)工作者和消費(fèi)者關(guān)注的重中之重[1]。市場上大眾消費(fèi)者已形成食用益生菌酸奶、益生菌功能食品調(diào)節(jié)腸道，改善身體健康的習(xí)慣，益生菌市場儼然成為一片巨大的藍(lán)海。

目前補(bǔ)充益生菌調(diào)理腸道菌群的手段主要有兩種，外部活菌補(bǔ)菌（即益生菌補(bǔ)菌）和內(nèi)部自身腸道菌增殖（即益生元補(bǔ)菌）。活菌補(bǔ)菌目前最為盛行，但一直存在著諸多不足飽受詬病，諸如定殖率低、活菌存活率、產(chǎn)品貨架期短等問題。而益生元作為腸道菌群的食物和促進(jìn)物質(zhì)，具有穩(wěn)定性好、貨架期長的天然優(yōu)勢，能很好地解決以上缺點，因此通過益生元或合生元（益生菌+益生元）補(bǔ)菌調(diào)理腸道菌群成為腸道健康重要的方向[2-4]。

益生元（prebiotics）是由GR. Gibson等[5]提出，是指一些不被宿主消化吸收卻能有選擇地促進(jìn)其體內(nèi)腸道有益菌的代謝和增殖，從而改善宿主健康的有機(jī)物質(zhì)。益生元具有以下特點：（1）不被宿主胃腸道消化或吸收；（2）只能被一種或有限幾種腸道菌利用；（3）能改善腸道菌群組成，增進(jìn)宿主健康；（4）誘導(dǎo)腸腔內(nèi)系統(tǒng)性免疫，改善宿主體質(zhì)。目前被廣泛熟知的益生元有低聚果糖、菊粉、低聚甘露糖、水蘇糖、低聚半乳糖、低聚木糖等。Markus[6]研究發(fā)現(xiàn)低聚果糖作為唯一的碳源時，對唾液乳桿菌W57的增殖效果較差，但卻能夠顯著促進(jìn)副干酪乳桿菌W20的生長增殖；夏曉風(fēng)[7]研究了六種常用低聚糖（低聚異麥芽糖，低聚果糖，低聚半乳糖，低聚木糖，乳酮糖和低聚乳糖）對乳酸菌（嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）和大腸桿菌（Escherichia coli）生長的影響，結(jié)果顯示乳酮糖替代量為25%時，保加利亞乳桿菌生長量最大；可見，不同腸道菌對特定的益生元的利用度存在較大差異[8-11]。

針對不同腸道菌對特定的益生元的利用度差異較大的問題，本研究選擇腸道代表性有益菌鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、加氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜黏蛋白阿克曼菌以及腸道有害菌陰溝腸桿菌共七種腸道菌，以及低聚半乳糖、低聚木糖、低聚甘露糖、水蘇糖、低聚果糖五種益生元作為研究對象，通過體外試驗，分析各益生元對腸道代表性菌增殖情況的影響，以期確定不同益生元對腸道菌群的影響規(guī)律，為益生元產(chǎn)品配伍及應(yīng)用開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

低聚甘露糖（85%，西安諾眾康健生物科技有限責(zé)任公司）；菊粉（90%，重慶驕王天然產(chǎn)物股份有限公司）；低聚木糖（95%，山東龍力生物科技股份有限公司）；水蘇糖（80%，西安天美生物科技股份有限公司）；低聚半乳糖（90%，山東百龍創(chuàng)園生物科技有限公司）。D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-木糖（北京索萊寶生物科技有限公司）。

腸道有益菌：鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosusATCC7469）、多形擬桿菌（BacteroidesthetaiotaomicronATCC29148）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilusATCC4356）、植物乳桿菌[Lactobacillus plantarum（Orla-Jensen）HollandATCC8014]、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillusreuteri、CICC 10855）、嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphilaCICC24917）、加氏乳桿菌（Lactobacillus gasseriCICC24878）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricusCICC20247）。

腸道有害菌：陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacaeCICC10450）。

上述菌種購置于中國微生物菌種保藏中心（ATCC）和中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院（CICC）。

1.1.2 試劑

酪蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、牛肉浸粉、脫水小牛腦浸粉、脫水牛心浸粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、氯化鈉、乙酸鈉、檸檬酸二銨、黏蛋白、Tween 80、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCO3、KH2PO4。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；LDZF-50L高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；厭氧培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司，LAI-3）；BDW-86L390-Y-80 ℃超低溫冰箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Alpha1502紫外分光光度儀（上海譜元儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基

MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基

酪蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，Tween 80 1.0 g，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.05 g，CaCO320.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 6.8。

BHI+2 g/L黏蛋白：脫水小牛腦浸粉12.5 g、脫水牛心浸粉5 g、蛋白胨10.0 g、葡萄糖2.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂20.0 g、2 g黏蛋白、蒸餾水1 000 mL、pH 6.8～ 7.4（Biobw菌種推薦培養(yǎng)基）。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：牛肉浸粉10.0 g，蛋白胨10.0 g，葡萄糖10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0～20.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 7.0。

缺碳培養(yǎng)基：將菌株可利用的培養(yǎng)基除去碳源，即為缺碳培養(yǎng)。

益生元培養(yǎng)基：缺碳培養(yǎng)基中加入2%重量比的益生元，則制備成相應(yīng)的益生元培養(yǎng)基。

1.3.2 培養(yǎng)方法

菌種活化：用無菌吸管吸取0.3～0.5 mL的液體培養(yǎng)基或者無菌水，滴入凍干管中，輕輕振蕩至其溶解。吸取全部菌懸液，接種在固體培養(yǎng)基上；操作完畢，平皿倒置，指定培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。

菌種液：挑取平皿上的單菌落接種至裝有菌落指定液體培養(yǎng)基的試管中，試管密封，指定培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，得一級菌懸液。

表1 培養(yǎng)條件

1.3.3 影響試驗

按3%接種量，將培養(yǎng)好的一級菌懸液分別接種至基礎(chǔ)培養(yǎng)基、缺碳培養(yǎng)基和益生元培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基裝液量為試管體積的90%，密封，于37 ℃厭氧袋內(nèi)培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)[12]。

1.3.4 生長測定

培養(yǎng)48 h，菌液用分光光度計在波長600 nm處測定吸光度（A）。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

研究的所有試驗處理均設(shè)計了3個生物學(xué)重復(fù)并進(jìn)行平行測定。數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析和Duncan法多重比較，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生元及單糖對腸道微生物的影響試驗

2.1.1 益生元對腸道有益菌的增殖試驗

益生元對益生菌的促增殖能力通常以發(fā)酵液的A600作為指標(biāo)以評價菌體數(shù)量。試驗確定菊粉、低聚木糖、水蘇糖、低聚半乳糖以及低聚甘露糖對5種乳桿菌的增殖規(guī)律，結(jié)果如圖1所示：（1）低聚甘露糖對鼠李糖乳桿菌、加氏乳桿菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌等4株乳桿菌有明顯的增殖效果，厭氧培養(yǎng)24 h，菌液吸光度均大于1.5，但對羅伊氏乳桿菌兩組菌株增殖效果較差。（2）水蘇糖對除加氏乳桿菌以外的其他4株乳桿菌有較好的增殖效果，厭氧培養(yǎng)24 h，菌液吸光度均大于1.0，對羅伊氏乳桿菌增殖效果最佳。（3）低聚半乳糖對羅伊氏乳桿菌和保加利亞乳桿菌2株乳桿菌有較好的增殖效果，厭氧培養(yǎng)24 h，菌液吸光度均大于1.5。（4）菊粉和低聚木糖對乳桿菌的增殖效果較差，厭氧培養(yǎng)有益菌24 h，A600多數(shù)都小于1.0。

圖1 不同益生元對乳桿菌的增殖效果

Akkermansia muciniphila是一種從糞便中分離到的嚴(yán)格厭氧腸道菌，在腸道中的豐度通常占1%～3%，可以利用腸道黏蛋白作為唯一碳源和氮源進(jìn)行生長，主要代謝產(chǎn)物為丙酸。Akkermansia muciniphila在腸道中的定殖與宿主的健康息息相關(guān)，它可以改善肥胖、糖尿病患者的炎癥反應(yīng)以及胰島素抵抗和葡萄糖耐受等不良癥狀，還可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，維持體內(nèi)代謝平衡，5種益生元中水蘇糖和低聚甘露糖對Akkermansia muciniphila的增殖效果優(yōu)于其他益生元，但均低于陽性對照葡萄糖（圖2）。

圖2 不同益生元對Akkermansia muciniphila的增殖效果

綜上可知，5種益生元中低聚甘露糖、水蘇糖和低聚半乳糖對乳桿菌等腸道有益菌表現(xiàn)出較好的增殖效果，菊粉和低聚木糖的增殖效果較差。

2.1.2 益生元對腸道有害菌的影響試驗

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）是腸桿菌目腸桿菌科腸桿菌屬的一種細(xì)菌，存在于人和動物的糞便水、泥土、植物中，是腸道致病菌種之一。5種益生元對其體外影響試驗結(jié)果顯示（圖3）：陰溝腸桿菌能夠更好地利用低聚木糖、菊粉，對低聚甘露糖、水蘇糖和低聚半乳糖利用率較低。

圖3 不同益生元對陰溝腸桿菌的影響

2.1.3 單糖對腸道微生物的影響試驗

腸道微生物對不同益生元的利用存在較大的差異，為了明確其原因，試驗進(jìn)一步測定了D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、D-木糖、D-甘露糖和D-阿拉伯糖對腸道微生物的影響規(guī)律，結(jié)果如圖4所示：（1）D-甘露糖對植物乳桿菌、加氏乳桿菌和保加利亞乳桿菌有較好的增殖效果；（2）D-果糖對除加氏乳桿菌和保加利亞乳桿菌以外其他菌種有較好的增殖效果；（3）D-半乳糖對加氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和保加利亞乳桿菌等3株乳桿菌增殖效果較好；（4）D-木糖和D-阿拉伯糖對乳桿菌的增殖效果較差。

圖4 不同單糖對乳桿菌的增殖效果

D-果糖和D-甘露糖對Akkermansia muciniphila的增殖效果優(yōu)于其他單糖，但均低于陽性對照葡萄糖（圖5）。

圖5 不同單糖對Akkermansia muciniphila的增殖效果

陰溝腸桿菌能夠更好地利用D-木糖、D-半乳糖，而對D-甘露糖利用率較低。

圖6 不同單糖對陰溝腸桿菌的影響

綜合上述低聚糖益生元和單糖益生元的試驗結(jié)果，將對幾種腸道益生元增殖效果較好的益生元和單糖匯總于表2。由表中結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，低聚半乳糖、低聚甘露糖、水蘇糖對多數(shù)腸道有益菌的增殖效果優(yōu)于其他益生元，而對有害菌陰溝腸桿菌的促生長效果不明顯。D-半乳糖、D-甘露糖和D-果糖對腸道有益菌增殖效果優(yōu)于其他單糖，推測低聚半乳糖、低聚甘露糖、水蘇糖對腸道有益菌增殖效果優(yōu)于其他益生元，可能與其對應(yīng)單糖增殖效果好且有益菌能夠產(chǎn)生高活性α-半乳糖苷酶和β-甘露聚糖酶相關(guān)。

表2 不同益生元和單糖增殖效果統(tǒng)計

2.2 復(fù)合益生元對腸道微生物的影響

根據(jù)上述試驗結(jié)果，將對腸道有益菌有較好增殖效果的3種益生元低聚甘露糖、低聚半乳糖和水蘇糖進(jìn)行兩兩復(fù)配，旨在篩選出對腸道有益菌有增殖效果，而對有害菌無明顯促生長作用的益生元組合。結(jié)果如表3所示。

表3 復(fù)合益生元對腸道菌群的影響試驗

低聚甘露糖和水蘇糖比例為3∶1（MOS∶Sta= 3∶1）時對5種乳桿菌和Akkermansia muciniphila有較好的增殖效果，且對陰溝腸桿菌無明顯促生長作用，可作為最佳的復(fù)合益生元組合。

3 結(jié)論

通過試驗研究了不同種類益生元（菊粉、低聚木糖、水蘇糖、低聚半乳糖和低聚甘露糖）對腸道有益菌鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、加氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌、Akkermansia muciniphila以及腸道有害菌陰溝腸桿菌的影響規(guī)律，得到如下結(jié)論：

1) 低聚甘露糖、低聚半乳糖、水蘇糖對多數(shù)有益菌的增殖效果優(yōu)于低聚木糖和菊粉，而對有害菌陰溝腸桿菌的促生長效果不明顯。通過D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖、D-阿拉伯糖和D-果糖各類單糖對腸道菌的體外試驗，明確D-半乳糖、D-甘露糖和D-果糖對腸道有益菌增殖效果較優(yōu)，推測益生元對某種腸道菌的增殖效果可能與其對應(yīng)單糖的增殖效果具有一定的相關(guān)性。

2) 低聚甘露糖和水蘇糖比例為3∶1（MOS∶Sta= 3∶1）時對腸道有益菌有較好的增殖效果，且對有害菌無明顯促生長作用，可作為最佳的復(fù)合益生元組合。