楊明朗，吳姝潔，董祺祺，趙燕昊，蔣玉蓉*，陸國權

1. 浙江農林大學現(xiàn)代農學院（杭州 311300）；2. 桐廬縣農業(yè)技術推廣中心（杭州 311599）

芋艿[Colocasiaesculenta（L.）Schott]，又稱芋頭、毛芋、芋魁等，屬天南星科多年生宿根性草本植物[1]，原產(chǎn)于印度、馬來群島及中國，現(xiàn)在熱帶及亞熱帶地區(qū)廣泛分布。芋艿富含淀粉、蛋白質以及生物活性大分子，具有美容養(yǎng)顏、潤腸滋脾、消癆解毒等作用[2]。芋艿蛋白具有易吸收、降血壓等優(yōu)點，其組分中有一種黏液蛋白，被人體吸收后能產(chǎn)生免疫球蛋白[3]。研究者對國內30余種芋艿品種的蛋白質含量及氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，芋艿的蛋白質含量平均為9.30%，含有18種氨基酸，包括8種人體必需氨基酸，且氨基酸含量與蛋白質含量呈正相關，氨基酸評分（amino acid ascore，ASS）為0.79[4]。國內外對芋艿的研究多集中于種植栽培、淀粉及多糖的粗加工，對芋艿蛋白分離提取及性質方面的研究甚少。國外對芋艿蛋白質的研究開始于1982年，Huang等[5]和Kaushal等[6]測定了芋艿蛋白質含量，結果分別為1.1%～2.5%。常銀子等[7]采用正交試驗優(yōu)化酶法提取芋艿蛋白質工藝，其得率為0.52%。黃友如等[8]通過優(yōu)化堿溶酸沉法制備芋艿分離蛋白，其得率約1.33%。上述兩種提取方法得率均較低。奉化芋艿是浙江省主要芋艿品種之一，個大皮薄，糯滑可口，粗蛋白含量可達14.10%，富含鈣、磷、鎂、鐵及VC等多種成分，營養(yǎng)價值豐富，因其獨特品質受到消費者的青睞[9]。此次研究以奉化芋艿為材料，采用響應面法對芋艿蛋白的木瓜蛋白酶法提取工藝進行優(yōu)化，并對芋艿蛋白質的體外抗氧化活性進行評價；同時比較8個芋艿推廣品種間蛋白含量差異，為芋艿蛋白的開發(fā)和高蛋白芋艿品種篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮奉化芋艿（購于寧波奉化）；牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、抗壞血酸（合肥千盛生物科技有限公司）；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸、無水乙醇（分析純，上海沃凱生物技術有限公司）；木瓜蛋白酶（酶活力10萬 U/g，南寧龐博生物工程有限公司）；DPPH粉末（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼，福州飛凈生物有限公司）。

Biosafer-10C臺式冷凍干燥機（南京賽飛生物科技有限公司）；HH-6恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；TG16-WS臺式高速離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）；紫外可見分光光度計（北京普斯通用儀器有限責任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理

取新鮮無損的成熟奉化芋艿，削皮并將表面洗凈，切片后放入冷凍干燥機凍干72 h，轉入恒溫鼓風干燥箱烘干3～5 h，磨成粉末，過0.150 mm（100目）孔徑篩，得到芋艿干粉，用密封袋保存于4 ℃恒溫冰箱。

1.2.2 蛋白標準曲線的繪制

蛋白標準曲線的繪制參考劉玉明等[10]的方法。稱取100 mg牛血清蛋白，將其充分溶解于蒸餾水并定容至100 mL，配制成1 mg/mL牛血清蛋白標準溶液。稱取0.1 g考馬斯亮藍G-250粉末，溶于50 mL 95%乙醇溶液，并加入100 mL 85%磷酸，加水稀釋至1 L，配制成考馬斯亮藍溶液，用棕色瓶保存。用移液槍分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL標準蛋白溶液于試管，并加蒸餾水定容至1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍溶液，混勻并靜置5 min，在波長595 nm處測定吸光度A，以蛋白質量濃度（mg/mL）為橫坐標（X），以吸光度A為縱坐標（Y）繪制標準曲線：Y=0.137 3X+0.000 5，R2=0.997 2。

1.2.3 芋艿蛋白質提取酶法提取

稱取1 g芋艿干粉，按照1∶20 g/mL的料液比加入蒸餾水溶于離心管，用0.1 mol/L的NaOH和HCl溶液將溶液的pH調到4～8，加入一定量木瓜蛋白酶（0.25%～ 2.5%），于恒溫水浴鍋（30～70 ℃）加熱（0.5～2.5 h）。待反應結束后，將離心管迅速放入95 ℃水浴鍋水浴5 min，常溫下冷卻后以轉速5 000 r/min離心20 min，取上清液測定蛋白質得率。用0.5 mol/L的NaOH和HCl溶液將蛋白提取液調至等電點（pH 2.8，由1.2.7可知），于4 ℃恒溫冰箱靜置24 h，以8 000 r/min的轉速離心30 min，去上清液取沉淀，將沉淀冷凍干燥48 h后得到芋艿蛋白質粉。

1.2.4 芋艿蛋白質得率的測定

取1 mL蛋白提取液于試管，加入5 mL考馬斯亮藍溶液，靜置5 min后在波長595 nm處測定其吸光度，將吸光度代入蛋白標準曲線的回歸方程，得到蛋白提取液的蛋白質量濃度，按照式（1）計算出芋艿蛋白質得率。

式中：Y為蛋白質得率；C為蛋白提取液質量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為芋艿干粉質量，g。

1.2.5 單因素試驗

固定各因素水平：料液比1∶20 g/mL，pH 7，酶用量2.0%，反應溫度50 ℃，反應時間2 h。分別考察pH（4，5，6，7和8）、酶用量（0.25%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%）、反應溫度（30，40，50，60和70 ℃）和反應時間（30，60，90，120和150 min）4個因素對芋艿蛋白質得率的影響。

1.2.6 響應面試驗

根據(jù)單因素水平的結果，利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件，以pH、酶用量、反應溫度、反應時間為自變量，以芋艿蛋白得率為響應值進行四因素三水平的試驗設計，優(yōu)化提取工藝。相關試驗因素水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平

1.2.7 芋艿蛋白質等電點測定

量取芋艿蛋白提取液分裝至離心管，每個離心管10 mL提取液，用0.5 mol/L的鹽酸和0.5 mol/L的NaOH調節(jié)pH分別為2.0，2.2，2.4，2.6，2.8，3.0，3.2，3.4，3.6，3.8和4.0，將離心管置于4 ℃恒溫冰箱箱沉淀24 h后，以8 000 r/min的轉速離心30 min，去除離心管中的沉淀，取上清液，采用考馬斯亮藍法在波長595 nm處測定吸光度，吸光度最低時的pH為芋艿蛋白質的等電點。

1.2.8 芋艿蛋白質抗氧化活性測定

將芋艿蛋白質粉分別配制成質量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL的蛋白溶液。VC可以清除自由基、促進細胞再生，具有很強的抗氧化活性，常被用來作為抗氧化性試驗的對照。配制對應濃度的VC溶液，比較芋艿蛋白與VC的抗氧化活性。

分別量取2 mL不同質量濃度芋艿蛋白溶液于棕色試管，加入2 mL現(xiàn)配制的0.2 mmol/L的DPPH溶液，充分振蕩混勻，在避光的條件下靜置30 min后，在波長517 nm處測定其吸光度，按照式（2）計算DPPH清除率，VC溶液測定方法同上。

式中：A0為蒸餾水與DPPH混合溶液的吸光度；A1為樣品與DPPH混合溶液的吸光度；A2為樣品與無水乙醇混合溶液的吸光度。

分別量取2 mL不同質量濃度的芋艿蛋白溶液于試管，加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液和6 mmol/L的雙氧水，搖勻并靜置100 min；加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸溶液，靜置20 min后在波長510 nm處測定其吸光度，按照式（3）計算羥自由基清除率。

式中：A0為蒸餾水替換樣品溶液的吸光度；A1為樣品溶液與混合液的吸光度；A2為蒸餾水替換雙氧水溶液的吸光度。

1.2.9 不同品種間蛋白質含量差異的研究

在優(yōu)化提取工藝條件下對海南芋艿、馬山芋艿、靖江香沙芋、雞爪芋等共8種不同品種芋艿進行蛋白質提取，測定其得率，研究其品種間差異。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復3次，取平均值；響應面設計采用Design-Expert. V8.0.6軟件；統(tǒng)計學分析采用Excel 2016軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶用量對芋艿蛋白質得率的影響

隨著酶用量的增加，芋艿蛋白質得率逐漸增大，酶用量2.0%時達最大值3.66%，酶用量繼續(xù)增加時，蛋白得率略微下降（圖1）。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是：當芋艿干粉濃度固定時，酶用量的增加使底物與木瓜蛋白酶的接觸面積和接觸概率增大，從而提高芋艿蛋白質得率；酶用量繼續(xù)增加時，酶濃度處于過飽和狀態(tài)，酶與底物發(fā)生競爭，導致部分酶分子不能和底物接觸，從而影響蛋白質得率[11]。綜合上述試驗現(xiàn)象，確定最佳酶用量為2%。

圖1 酶用量對芋艿蛋白質得率的影響

2.1.2 pH對芋艿蛋白質得率的影響

隨著pH逐漸增大，芋艿蛋白質得率隨之增大，pH 7時達最大值3.04%，當pH繼續(xù)增大時，蛋白質得率開始下降（圖2）。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是：酶分子是特殊的蛋白分子，由1個或若干個活性部位組成酶的活性部位只有保持一定空間構象才能存在，其催化功能才能實現(xiàn)[12]。pH較低時，木瓜蛋白酶的空間構象受到破壞，活性較低；pH達到適宜條件后，酶具有較高的催化水解活性，從而提高蛋白質得率。綜合上述試驗現(xiàn)象，確定最佳pH為7。

圖2 pH對芋艿蛋白質得率的影響

2.1.3 反應時間對芋艿蛋白質得率的影響

隨著反應時間的增加，芋艿蛋白質得率隨之增加，反應時間60 min時達最大值3.37%，反應時間繼續(xù)增加時，蛋白得率下降（圖3）。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是：酶與底物隨時間推移逐漸反應完全，在60 min時反應基本完成；反應時間繼續(xù)增加時，蛋白質可能會出現(xiàn)凝聚沉淀現(xiàn)象，在離心時與殘渣一同被去除，從而影響蛋白質得率[13]。故確定最佳反應時間為60 min。

圖3 反應時間對芋艿蛋白質得率的影響

2.1.4 反應溫度對芋艿蛋白質得率的影響

隨著反應溫度的上升，芋艿蛋白質得率隨之增加，反應溫度50 ℃時達最大值3.74%，當溫度繼續(xù)上升時，蛋白得率下降（圖4）。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是：反應溫度低于酶反應最適溫度時，隨著溫度的上升，酶的反應速度提高，從而提高蛋白質得率；過高的溫度可能會導致酶的活性降低及蛋白質的變性[14]，使蛋白質得率降低。所以確定最佳反應溫度為50 ℃。

圖4 反應溫度對芋艿蛋白質得率的影響

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面設計及結果

分析單因素試驗的結果，綜合考慮試驗要求，決定以酶用量2%、pH 7、反應時間60 min、反應溫度50 ℃為中心點，設計四因素三水平中心組合試驗。響應面設計方案及結果如表2所示。

表2 響應面試驗優(yōu)化設計及結果

2.2.2 響應面模型的分析

利用Design-Expert. V8.0.6.1軟件分析表2數(shù)據(jù)的響應面回歸參數(shù)，以芋艿蛋白質得率為響應值，得到回歸方程：Y=-10.611 08+7.785 33A+0.263 83B- 0.011 067C+0.254 25D-0.6AB-2.333 33×10-3AC-0.1AD+4.75×10-3BC+0.014 750BD+6×10-4CD- 1.644 67A2-0.091 167B2-4.526 85×10-4C2-3.749 17× 10-3D2。模型的方差分析結果如表3所示。

表3 回歸模型方差分析

由表3可知，該回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬差不顯著（P＞0.05），說明其他未知干擾因子對試驗結果影響較小，模型與實際情況擬合較好。模型決定系數(shù)R2=0.976 8，模型校正系數(shù)Radj2=0.953 6，說明模型能解釋95.36%響應值的變化，試驗值與預測值在試驗范圍內的一致性較高，可用于對芋艿蛋白質的得率進行結果分析和預測。在模型中，一次項A（酶用量）、B（pH）、C（反應時間）對芋艿蛋白質得率影響極顯著（P＜0.01），D（反應溫度）對蛋白質得率影響不顯著（P＞0.05）；交互項中，BC、BD、CD對蛋白質得率影響極顯著，其余對蛋白質得率影響不顯著；二次項均為極顯著。根據(jù)4個單因素F值判斷，影響芋艿蛋白質得率因素的順序為反應時間＞pH＞酶用量＞反應溫度。

2.2.3 響應面各因素交互作用分析

為更直觀地反映pH與反應時間（BC）、pH與反應溫度（BD）、反應時間與反應溫度（CD）3個兩因素交互作用對蛋白質得率的影響規(guī)律，分別將模型中其他兩個因素水平固定為0，繪制相應的等高線圖及三維曲面圖。通過觀察等高線圖橢圓的曲線水平及三維曲面圖坡度情況，反映兩因素交互作用的顯著性。橢圓形程度越高，表明交互作用越顯著；響應面圖的坡面越陡，表示交互作用的影響程度越深。結果如圖5～圖7所示。

圖5表示在固定酶用量2.0%、反應溫度50 ℃時，pH與反應時間交互作用對芋艿蛋白質得率的影響。pH一定時，蛋白質得率隨反應時間先上升后下降；當反應時間一定時，pH為7可以得到較高的蛋白質得率。由響應面圖中可知，坡面在反應時間一側更為陡峭，等高線相對密集，表明反應時間對蛋白質得率的影響大于pH。

圖5 pH與反應時間交互作用等高線和響應面圖

圖6表示在固定酶用量2.0%、反應時間60 min時，pH與反應溫度交互作用對芋艿蛋白質得率的影響。在pH一定時，蛋白質得率隨反應溫度先上升后下降；當反應溫度一定時，pH為7可以得到較高的蛋白質得率。由響應面圖中可知，坡面在pH一側更為陡峭，等高線相對密集，表明pH對蛋白質得率的影響大于反應溫度。

圖6 pH與反應溫度交互作用等高線和響應面圖

圖7表示在固定酶用量2.0%、pH 7時，反應時間與反應溫度交互作用對芋艿蛋白質得率的影響。在反應時間一定時，蛋白質得率隨反應溫度先上升后下降；當反應溫度一定時，反應時間60 min可以得到較高的蛋白質得率。由響應面圖中可知，坡面在反應時間一側更為陡峭，等高線相對密集，表明反應時間對蛋白質得率的影響大于反應溫度。

圖7 反應時間與反應溫度交互作用等高線和響應面圖

2.2.4 工藝驗證試驗

利用Design-Expert. V8.0.6軟件對回歸模型的參數(shù)進行優(yōu)化，確定芋艿蛋白質得率的最佳工藝條件：酶用量2.08%、pH 6、反應時間44.72 min、反應溫度46.51 ℃。預測的蛋白質得率為3.788%。為證明響應面優(yōu)化工藝的可靠性，進行驗證試驗，結合實際操作合理性，將工藝參數(shù)確定為酶用量2.1%、pH 6、反應時間45 min、反應溫度46.5 ℃。進行3次重復試驗取平均數(shù)，芋艿蛋白質得率為3.78%，與預測值偏差0.3%，說明優(yōu)化后的提取參數(shù)條件可靠，可用于實際生產(chǎn)操作。

2.3 芋艿蛋白質等電點

當?shù)鞍踪|處于等電點時，蛋白質分子所攜帶的正負電荷數(shù)相同，電荷作用力抵消[15]，蛋白質顆粒容易發(fā)生碰撞，并因失去電荷和脫水而析出。如圖9所示，當pH在2.8附近，芋艿蛋白上清液的吸光度最低。說明在pH 2.8時溶液中含有的蛋白質含量最少，為該芋艿蛋白的等電點。

圖9 芋艿蛋白質等電點

2.4 芋艿蛋白質抗氧化活性

抗氧化劑能使DPPH溶液發(fā)生自由基清除現(xiàn)象，作用表現(xiàn)為溶液紫色削弱或消失，同時在波長517 nm處吸光度變小，表示抗氧化作用較強[16]。如圖10所示：在0.2～0.6 mg/mL的質量濃度范圍內，隨著質量濃度上升，芋艿蛋白溶液對DPPH的清除率迅速增大；在0.6～1.0 mg/mL質量濃度范圍時，蛋白質對DPPH的清除率上升緩慢并趨于穩(wěn)定。利用prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，得出芋艿蛋白質對DPPH·的IC50=0.398 7 mg/mL，其IC50值小于10 mg/mL，這表明芋艿蛋白質具有較為良好的抗氧化活性[16]。而VC溶液對DPPH的清除能力穩(wěn)定在95%～95.5%的范圍內，且波動很小，說明芋艿蛋白質對DPPH自由基的清除能力小于VC。

圖10 芋艿蛋白質與VC對DPPH自由基的清除能力

羥基是極其活躍的自由基，可與活細胞內的分子進行反應，致細胞分子組織的過氧化，從而引發(fā)疾病，而游離的氨基酸可以較快地與·OH結合，從而達到清除作用[17]。如圖11所示，在0.2～1.0 mg/mL的質量濃度范圍內，芋艿蛋白對羥自由基的清除能力逐漸增強。利用prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，芋艿蛋白質對·OH的IC50為0.496 3 mg/mL，表明芋艿蛋白對羥自由基具有良好的清除能力。

圖11 芋艿蛋白質與VC對羥自由基的清除能力

2.5 芋艿蛋白質含量的品種間差異

采用最佳工藝條件，對不同芋艿品種蛋白質得率測定，結果如表4所示。芋艿蛋白質得率在不同品種間具有較大差異，變異幅度在1.58%～3.96%，平均得率為3.13%，變異系數(shù)為26.2%。說明不同品種的蛋白質含量有較大差異，通過合適的育種途徑，可以篩選到高蛋白的芋艿品種。

表4 不同種芋艿蛋白質得率

3 結論

采用響應面分析法對酶法提取芋艿蛋白質的工藝進行優(yōu)化，最佳提取工藝條件為酶用量2.1%，pH 6，反應時間45 min，反應溫度46.5 ℃。在此條件下，芋艿蛋白質得率為3.78%，與預測值3.79%擬合程度極高，相較于同類研究[8-9]提取工藝得率分別提高6.2倍和1.8倍。同時，抗氧化性的分析表明，芋艿的蛋白質對DPPH·和·OH均具備較強的清除能力，其IC50分別為0.398 7和0.496 3 mg/mL。此外，不同品種的芋艿之間蛋白質含量差異明顯，其中雞爪芋的蛋白質含量最高，得率達3.96%，而海南芋艿得率最低，為1.58%。試驗結果為高蛋白芋艿品種的選育提供理論基礎。