李程錦，尚懷國，蘇霞，郭文秀，王瀚悅，門興元，李麗莉，宋瑩瑩，高龍飛，馬國蘋，于毅

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/山東省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，北京 100125；3.山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，山東 濟(jì)南 250100)

丹參(Salvia miltiorrhizaBunge)又名赤參、山參、紅參、紫丹參等，入藥歷史悠久，是唇形科鼠尾草屬植物[1]，種植范圍分布于遼寧、北京、山東、河南等地[2，3]，是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中使用最早和最普遍的中藥材之一[4-6]。現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)中它主要應(yīng)用于治療心血管疾病、缺血性腦卒中和惡性腫瘤等疾病，還具有養(yǎng)血、安神等功效[7-9]。

根腐病是丹參生產(chǎn)中的一種主要病害，近年來，隨著連作和種植結(jié)構(gòu)的改變而普遍發(fā)生，危害嚴(yán)重。根腐病主要危害丹參根部，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。發(fā)病初期，最先危害丹參的側(cè)根和須根，發(fā)病部位呈水漬狀，后由紅褐色逐漸加深，并迅速擴(kuò)展到主根，根切后可以看到維管束發(fā)生褐色病變，后期根皮呈纖維狀，極易拔出，植株地上部枯萎[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)，根腐病的主要致病菌為鐮刀菌[13]。鐮刀菌的寄主范圍廣，能從根部侵染多種植物，發(fā)生根腐病，是重要的植物病原菌[14]。

山東省蒙陰縣連城鎮(zhèn)對山莊村丹參根腐病發(fā)生較重，發(fā)病率較高，致使丹參產(chǎn)量下降，品質(zhì)降低。因此，為更加有效地防控丹參根腐病，降低丹參根腐病的發(fā)病率，提高收入，本試驗(yàn)對該地區(qū)丹參根腐病進(jìn)行病原菌的分離鑒定、致病性測定和藥劑篩選，以期為防治丹參病害提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

于2019年10月在山東省蒙陰縣連城鎮(zhèn)對山莊村發(fā)病嚴(yán)重區(qū)域采集具有典型根腐病癥狀丹參病株。

1.2 病原菌的分離與純化

將病株洗凈晾干，在超凈工作臺(tái)上用手術(shù)刀從病健交界處切取約1 cm2的組織塊，75%乙醇消毒30 s后，再用1%次氯酸鈉溶液消毒10 s、無菌水漂洗3次[15]，最后用滅菌濾紙吸干多余水分，接種于PDA培養(yǎng)基中央，25℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5 d，待菌絲長出后采用挑取菌絲尖端法進(jìn)行多次純化。

1.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將分離得到的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1～2周，肉眼觀察菌絲的生長狀況、菌落顏色和質(zhì)地；顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、孢子類型、孢子形狀、有無隔膜等，并拍照。根據(jù)觀察到的病原菌形態(tài)特征，參考《植物病原真菌學(xué)》[16]對病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

將分離菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5～7 d。刮取200 mg新鮮菌體，用研磨器研磨后按DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取，4℃冰箱保存。

采用真菌rDNA-ITS序列通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17]。PCR擴(kuò)增體系(25 μL):2×EsTaqPlus Master-Mix(Dye)12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。4℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。將測定的rDNA-ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastn比對分析。使用MEGA 7.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的種類。

1.5 病原菌的致病性測定

菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d，用無菌水配制成濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液[18]。室溫條件下采用灌根接種法[19]將孢子懸浮液均勻接種在丹參健株根部周圍，接種量為10 mL/株[20]，對照組用無菌水澆灌植株。每個(gè)處理重復(fù)3次，分別在接種第10、20、30 d觀察植株發(fā)病情況。待接種丹參植株出現(xiàn)根腐病的典型癥狀后，切取植株發(fā)病部位的病健交界處，再次分離病原菌，比較前后兩次得到的病原菌是否相同，即按柯赫氏法則完成對病原菌的回接及再分離試驗(yàn)。

1.6 室內(nèi)藥劑篩選

供試藥劑:98%吡唑醚菌酯原藥、96%嘧菌酯原藥、95%丙環(huán)唑原藥、96.3%苯醚甲環(huán)唑原藥、2 000億/克孢子枯草原粉，均購自山東康喬生物科技有限公司。

采用菌絲生長速率法[21]進(jìn)行丹參根腐病菌對5種供試藥劑的敏感性測定。將供試藥劑配制成不同濃度梯度的含藥培養(yǎng)基，以等體積無菌水為對照，每個(gè)處理重復(fù)3次。將分離菌株接種到含有不同殺菌劑濃度的PDA平板上，25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。7 d后測量不同藥劑濃度菌落直徑，并計(jì)算抑制率[22]。

抑制率(%)＝(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑×100 。

利用DPS 7.05軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析，以藥劑濃度對數(shù)作為橫坐標(biāo)，以抑制率轉(zhuǎn)換為幾率值作為縱坐標(biāo)，求相關(guān)系數(shù)(r)、毒力回歸方程，從而計(jì)算各種供試藥劑對病原菌的抑制中濃度(EC50)[23]。

1.7 盆栽藥效試驗(yàn)

供試藥劑:40%丙環(huán)唑(山東兆豐年生物科技有限公司)、10%苯醚甲環(huán)唑(先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司)。

灌根接種法:將分離菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d，用無菌水配制成孢子懸浮液，濃度約為1×106個(gè)/mL。室溫條件下將分生孢子懸浮液均勻接種在丹參健株根圍，接種量為10 mL/株，定期觀察并記錄植株的發(fā)病情況。配制6個(gè)不同濃度梯度的藥劑，待丹參植株表現(xiàn)明顯癥狀后，對患病丹參植株進(jìn)行灌藥處理，以無菌水為對照。分別于灌藥10、20 d后觀察丹參植株的發(fā)病情況，并統(tǒng)計(jì)丹參植株的病情指數(shù)。

丹參根腐病分級標(biāo)準(zhǔn)[24]:0級，無??；1級，根莖有少量病斑；3級，根莖病斑較多，維管束褐色，尚未木質(zhì)化；5級，病根有部分開始腐爛，腐爛部分占根莖體積30%以下；7級，腐爛部分占根莖體積30%以上，地上部植株萎蔫變黃；9級，根莖腐爛，植株枯死。

病情指數(shù)＝∑(各級病級株數(shù)×各級級值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級值)×100 ；

防治效果(%)＝(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100 。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)特征

經(jīng)分離純化共得到3種不同形態(tài)的菌株，分別命名為形態(tài)組Ⅰ、形態(tài)組Ⅱ和形態(tài)組Ⅲ。形態(tài)組Ⅰ菌株氣生菌絲為黑色，形態(tài)組Ⅲ菌株氣生菌絲絨毛狀，產(chǎn)淺粉色色素，平均日生長量分別為5.8 mm和5.9 mm，孢子呈橢圓形；形態(tài)組Ⅱ菌株氣生菌絲為絨毛狀，不產(chǎn)色素，平均日生長量為7mm，孢子呈鐮刀形(圖1)。

圖1 病原菌菌落形態(tài)

根據(jù)觀察到的病原菌形態(tài)特征，再參考相關(guān)文獻(xiàn)，初步確定病原菌為鐮刀菌屬真菌。

2.2 病原菌分子生物學(xué)鑒定

丹參根腐病病原菌形態(tài)組Ⅰ菌株rDNA-ITS擴(kuò)增序列約538 bp，形態(tài)組Ⅱ菌株約527 bp，形態(tài)組Ⅲ菌株約548 bp(圖2)。由系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)可知，形態(tài)組Ⅰ和形態(tài)組Ⅲ菌株與尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporumstrain WZ-67)親緣關(guān)系最近；形態(tài)組Ⅱ菌株與木賊鐮刀菌(Fusarium equisetistrain UMAS MS25)親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定丹參根腐病病原菌為尖孢鐮刀菌和木賊鐮刀菌。

圖2 3種形態(tài)菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖3 基于rDNA-ITS序列采用鄰近法構(gòu)建代表菌株及其相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 致病性分析

接種分離菌10 d后丹參葉片開始出現(xiàn)變色萎蔫癥狀，20 d后丹參地上部分根莖逐漸開始變色進(jìn)而枯黃，30 d后發(fā)病嚴(yán)重植株出現(xiàn)明顯干枯癥狀。此時(shí)取發(fā)病嚴(yán)重丹參植株帶回實(shí)驗(yàn)室后將根部洗凈，發(fā)現(xiàn)地下部分出現(xiàn)明顯腐爛癥狀。第30 d發(fā)病率分別達(dá)81%、75%、84%(表1)，發(fā)病植株癥狀與田間癥狀相同，且對照組無發(fā)病癥狀。將患病根部進(jìn)行病原菌分離，得到的病原菌特征與原接種病原菌相同，并且分離純化后的病原菌80%為形態(tài)組Ⅱ菌株，證明木賊鐮刀菌是丹參根腐病的主要致病菌。

表1 病原菌的致病性測定

2.4 室內(nèi)藥劑篩選

通過計(jì)算抑制率可以判斷供試藥劑相對毒力大小，抑制率高的藥劑相對毒力就大[25]。結(jié)果(表2)表明，5種藥劑對木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌都有一定的抑制效果，且抑制率與藥劑濃度成正比，但不同藥劑之間抑制效果存在差異。95%丙環(huán)唑?qū)δ举\鐮刀菌和尖孢鐮刀菌抑制效果較好，濃度為1 100、2 200、4 400 mg/L時(shí)對木賊鐮刀菌的抑制率分別為81.28%、90.08%、94.85%；275、550、1 100、2 200、4 400 mg/L的95%丙環(huán)唑?qū)怄哏牭毒囊种坡史謩e為84.63%、90.07%、96.86%、100%、100%。96.3%苯醚甲環(huán)唑?qū)δ举\鐮刀菌的抑制效果較好，濃度為480、960、1 920、3 840 mg/L時(shí)對木賊鐮刀菌的抑制率分別為84.04%、85.08%、87.36%、88.07%。2 000億/克孢子枯草原粉對尖孢鐮刀菌的抑制效果較好，濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L時(shí)對尖孢鐮刀菌的抑制率分別為83.39%、86.81%、89.25%、89.89%、91.20%。96%嘧菌酯和98%吡唑醚菌酯對木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌抑制效果較差。

表2 5種藥劑對丹參根腐病病原菌菌絲生長的影響

2.5 5種藥劑對丹參根腐病病原菌的室內(nèi)毒力

98%吡唑醚菌酯、96%嘧菌酯、95%丙環(huán)唑、96.3%苯醚甲環(huán)唑、2 000億/克孢子枯草原粉對木賊鐮刀菌的EC50分別為474.1955、837.5054、97.0750、17.6659、0.3195 mg/L，對尖孢鐮刀菌的EC50分 別 為92.8179、1 820.2780、46.4313、16.0471、0.0520 mg/L(表3)。因此，5種藥劑對木賊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌的毒力均為2 000億/克孢子枯草原粉＞96.3%苯醚甲環(huán)唑＞95%丙環(huán)唑＞98%吡唑醚菌酯＞96%嘧菌酯。

表3 丹參根腐病病原菌對5種藥劑的敏感性

2.6 盆栽藥效試驗(yàn)

盆栽藥效試驗(yàn)結(jié)果(表4)表明，分別用100、200、300、400、500、600 mg/L的10%苯醚甲環(huán)唑處理患病丹參植株，10 d后藥劑的防治效果分別為14.65%、31.82%、32.83%、49.75%、63.38%、78.54%，20 d后藥劑的防治效果分別為38.11%、49.48%、67.31%、68.88%、78.91%、88.99%。分別用500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L的40%丙環(huán)唑處理患病丹參植株，10 d后藥劑的防治效果分別為22.73%、27.27%、27.27%、36.36%、77.27%、79.55%，20 d后藥劑的防治效果分別為44.93%、47.03%、58.04%、74.83%、89.69%、91.96%。由此可知，10%苯醚甲環(huán)唑和40%丙環(huán)唑?qū)Φ⒏〉姆乐涡Ч^好，并且防治效果隨藥劑濃度的升高而增加。

表4 丹參根腐病盆栽藥效試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

鐮刀菌屬是目前為止發(fā)現(xiàn)的真菌病原體中危害較為嚴(yán)重的屬種之一[26]，可在許多經(jīng)濟(jì)作物中引發(fā)多種病害，例如根腐病、莖腐病、維管束枯萎病和果實(shí)腐爛病[27]。國內(nèi)關(guān)于丹參根腐病的研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)丹參根腐病的病原菌存在一定差異。山東省萊蕪地區(qū)引起丹參根腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌，聊城市和四川省的病原菌則為腐皮鐮刀菌[22]。本研究發(fā)現(xiàn)山東省蒙陰縣連城鎮(zhèn)對山莊村丹參根腐病病原菌為木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌。

唐菲菲[28]研究發(fā)現(xiàn)，10%苯醚甲環(huán)唑能夠有效抑制由尖孢鐮刀菌引起的桔梗根腐。劉昌云等[29]在防治黃連根腐病時(shí)發(fā)現(xiàn)25%丙環(huán)唑可有效抑制菌絲活性以及病原菌生長。張成玲等[30]研究表明，枯草芽孢桿菌在田間防治由尖孢鐮刀菌引起的甘薯根腐病效果最好。本研究中，0.4 mg/L的2 000億/克孢子枯草原粉對尖孢鐮刀菌的抑制率為91.20%；3 840 mg/L的96.3%苯醚甲環(huán)唑?qū)δ举\鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的抑制率分別為88.07%、79.07%；4 400 mg/L的95%丙環(huán)唑?qū)δ举\鐮刀菌的抑制率為94.85%，2 200 mg/L的95%丙環(huán)唑?qū)怄哏牭毒囊种坡蕿?00%。這些試驗(yàn)結(jié)果為實(shí)際生產(chǎn)中防治丹參根腐病提供了理論依據(jù)。在用藥劑防治丹參根腐病的同時(shí)，可配合其他防治措施如農(nóng)業(yè)防治、生物防治等來提高丹參根腐病的防控效果。

本研究鑒定出的山東省蒙陰縣連城鎮(zhèn)對山莊村丹參根腐病的病原菌為木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌，兩種病菌均能單獨(dú)引起丹參根腐病，但兩種病菌的生物學(xué)特性有待進(jìn)一步測定。室內(nèi)藥劑篩選和盆栽藥效試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2 000億/克孢子枯草原粉、96.3%苯醚甲環(huán)唑和95%丙環(huán)唑?qū)Φ⒏〔≡囊种坡省?0%苯醚甲環(huán)唑和40%丙環(huán)唑?qū)Φ⒏〉姆乐涡Ч^好，但是其田間防治效果、藥劑殘留量等問題還有待進(jìn)一步研究。