朱紅霞，李賽楠，蘇文青，李小輝，張家洋

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)市金苑邦達(dá)富農(nóng)業(yè)科技有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453003)

鉻(Cr)是對人體毒害最大的五種重金屬元素之一，主要以兩種價(jià)態(tài)——Cr3+和Cr6+存在，其中，Cr6+對生態(tài)環(huán)境的影響尤為嚴(yán)重，可誘使生物體產(chǎn)生突變、癌變和畸變[1]，并可抑制植物種子萌發(fā)、降低生物量、破壞光合作用、打破活性氧代謝平衡、干擾養(yǎng)分吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)等，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物死亡[2，3]。

褪黑素(melatonin，MT)即N-乙酰基-5-甲氧基色胺，屬于吲哚類色胺，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)。MT不僅對植物生長過程具有良好的調(diào)控能力，而且對各種不良環(huán)境因素造成的傷害也有一定的抵御作用，能夠使植物對低溫、干旱、高鹽、重金屬脅迫等逆境的抵抗力得以增強(qiáng)[4]。目前已知MT可通過激發(fā)抗氧化酶系統(tǒng)清除氧自由基，間接促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成，修飾細(xì)胞壁，從而減輕細(xì)胞損傷，緩解植物重金屬脅迫[5]。如鎳(Ni)脅迫下添加MT可明顯促進(jìn)水稻(Oryza sativa)幼苗根系生長，降低O2·-產(chǎn)生速率，提高可溶性蛋白含量[6]。砷(As)脅迫下，外源MT能夠提高水稻種子萌發(fā)能力、幼芽抗氧化酶活性和根系活力，減輕膜脂過氧化損害[7]。鎘(Cd)脅迫下，MT處理能提高大頭菜(Brassica junceavar.megarrhiza)幼苗的光合色素含量，降低各器官Cd積累[8]；提高蘿卜(Raphanus sativusL.)葉片抗氧化酶活性，降低活性氧積累，緩解氧化脅迫[9]；通過提高抗氧化防御能力，增強(qiáng)油菜(Brassica napusL.)對Cr的抗逆性[10]。

百日草(Zinnia elegans)為菊科一年生草本花卉[11]?；ㄉG麗、株型美觀、花期長、觀賞價(jià)值高，是園林綠化的常用花卉。目前，對百日草的研究主要集中在栽培應(yīng)用等方面，施加外源物質(zhì)調(diào)控耐重金屬Cr脅迫的研究較少，MT對抗性的調(diào)控在園林植物中應(yīng)用的報(bào)道也不多見。因此，本試驗(yàn)研究了施加不同濃度外源MT對Cr脅迫下百日草種子萌發(fā)和幼苗生理的影響，旨在為緩解重金屬脅迫對植物的毒害研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021年9—11月在河南新鄉(xiāng)學(xué)院植物生態(tài)實(shí)驗(yàn)室和植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。供試百日草品種為‘夢境’，購自青島黃瀧種子有限公司。供試外源MT(分析純，純度99%)，南京都萊生物技術(shù)有限公司。供試Cr脅迫試劑為重鉻酸鉀(K2Cr2O7，分析純)，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 種子萌發(fā)試驗(yàn) 2021年9月初對百日草種子Cr敏感度進(jìn)行了前期試驗(yàn)，結(jié)果表明用100μmol/L K2Cr2O7處理后，其根長僅約為對照的1/4，受到了較大程度傷害但不致死，因而確定本試驗(yàn)最適Cr脅迫濃度為100 μmol/L。

2021年9月25日，選取整齊度一致、籽粒完整且品質(zhì)好的百日草種子，先用自來水洗去表面雜質(zhì)，然后用10%次氯酸鈉消毒10 min，無菌水沖洗后溫水(28℃)浸泡12 h。在每個(gè)鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿(φ＝90 mm)中擺放浸泡好的百日草種子50粒，分別加入10 mL含有不同濃度Cr和MT的處理液。試驗(yàn)設(shè)7個(gè)處理，具體見表1，每個(gè)處理重復(fù)4次。將所有培養(yǎng)皿置于溫度25℃、相對濕度75%、14 h光照/10 h黑暗、光照強(qiáng)度為500 μmol/(m2·s)的環(huán)境中培養(yǎng)，并以稱重法增補(bǔ)水分以維持處理液濃度基本恒定。以胚根突破種皮1 mm視為有效萌發(fā)，每天定時(shí)記錄種子萌發(fā)情況，連續(xù)培養(yǎng)7 d。

表1 各處理MT和Cr濃度 (μmol/L)

依據(jù)《國際種子檢驗(yàn)規(guī)程》[12]，分別于第4天和第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢和發(fā)芽率:

式中:Gt指t日內(nèi)發(fā)芽數(shù)，Dt指相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)，S指萌發(fā)第7天幼苗的長度。

1.2.2 幼苗培養(yǎng)試驗(yàn) 2021年10月15日開始進(jìn)行幼苗生長試驗(yàn)。種子消毒方法同1.2.1。消毒后將百日草種子均勻播種于裝有滅過菌的珍珠巖育苗缽(直徑18 cm，高16 cm)內(nèi)，前期每天用適量蒸餾水澆灌，出苗7 d后間苗，每盆留長勢一致、分布整齊的幼苗20株，換1/2劑量的Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待幼苗長至10 cm左右進(jìn)行試驗(yàn)處理。將K2Cr2O7用1/2Hoagland營養(yǎng)液配制成Cr濃度為100 μmol/L的溶液對幼苗進(jìn)行澆灌，將MT配制成濃度分別為0、50、100、200、400、600 μmol/L的溶液進(jìn)行葉面噴施。試驗(yàn)設(shè)7個(gè)處理，同表1，每個(gè)處理30缽。CK1從處理之日起每3 d在百日草葉面噴灑蒸餾水1次至葉面全濕，有液珠滴落為止，并在處理當(dāng)日向營養(yǎng)缽中澆灌1/2Hoagland營養(yǎng)液20 mL，處理第7天再次澆灌1/2Hoagland營養(yǎng)液20 mL；CK2從處理之日起每3 d在百日草葉面噴灑蒸餾水1次至葉面全濕，有液珠滴落為止，在處理當(dāng)日和第7天向營養(yǎng)缽中分別澆灌100 μmol/L Cr脅迫溶液20 mL；T1—T5從處理之日起每3 d在百日草葉面噴灑相應(yīng)濃度的MT溶液1次至葉面全濕，有液珠滴落為止，并在處理當(dāng)日澆灌100 μmol/L Cr脅迫溶液20 mL，處理第7天再次澆灌100 μmol/L Cr脅迫溶液20 mL。第14天收樣，選取生長同部位的葉片測定各生理指標(biāo)。

可溶性糖和可溶性蛋白含量的測定參照陳建勛[13]的方法；葉綠素含量采用80%丙酮浸提法測定[14]；丙二醛(MDA)含量的測定參照寇江濤等[15]的方法；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性的測定參照高俊鳳[16]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與繪圖，SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用ANOVA和LSD法進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源MT對Cr脅迫下百日草種子萌發(fā)的影響

從表2可以看出，與CK1相比，Cr脅迫(CK2)顯著抑制了百日草種子萌發(fā)(P＜0.05)，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別降低25.94%、30.12%、32.21%和47.28%。Cr脅迫下噴施不同濃度MT后，隨MT濃度的增加各萌發(fā)指標(biāo)呈先升高后降低的規(guī)律。T1、T2、T3和T4處理對Cr脅迫下百日草種子萌發(fā)有顯著促進(jìn)作用(P＜0.05)，其中T2處理效果最佳，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)較CK2分別升高27.42%、37.35%、46.39%和82.63%。隨著MT濃度的進(jìn)一步升高，T3和T4處理的促進(jìn)作用明顯下降，T5處理各指標(biāo)與CK2不存在顯著差異(P＞0.05)。

表2 外源MT對Cr脅迫下百日草種子萌發(fā)的影響

2.2 外源MT對Cr脅迫下百日草幼苗可溶性糖、可溶性蛋白含量的影響

如圖1所示，與CK1相比，Cr脅迫(CK2)下百日草幼苗中可溶性糖、可溶性蛋白含量均顯著升高(P＜0.05)，分別升高了14.27%和20.34%。與CK2相比，各噴施外源MT處理的可溶性糖、可溶性蛋白含量均明顯升高，除T5處理下可溶性糖含量差異不顯著外，其他處理差異均達(dá)顯著水平(P＜0.05)，且均在T2處理下達(dá)到最大值，較CK2分別升高49.53%和54.14%，此后隨MT濃度的繼續(xù)升高呈降低趨勢。表明適宜濃度的MT在一定程度上可以提高Cr脅迫下百日草幼苗的滲透調(diào)節(jié)能力，增強(qiáng)對Cr脅迫的抗性。

圖1 外源MT對Cr脅迫下百日草幼苗可溶性糖(A)和可溶性蛋白(B)含量的影響

2.3 外源MT對Cr脅迫下百日草幼苗葉綠素含量的影響

由表3可見，與CK1相比，Cr脅迫(CK2)處理下百日草幼苗的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量顯著下降(P＜0.05)，分別降低39.49%、54.35%和43.67%。施加MT后，隨MT濃度的增加，葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量呈先升后降趨勢，均在T2處理時(shí)達(dá)到最大值，較CK2分別升高62.91%、136.50%和79.71%；但繼續(xù)升高M(jìn)T濃度對Cr脅迫的緩解作用逐漸減弱，百日草幼苗葉綠素含量下降，但仍均顯著高于CK2。表明噴施外源MT可緩解Cr脅迫對百日草幼苗光合色素積累的損害。

表3 外源MT對Cr脅迫下百日草幼苗葉綠素含量的影響 (mg/g)

2.4 外源MT對Cr脅迫下百日草幼苗MDA含量的影響

由圖2可知，Cr脅迫(CK2)處理下百日草幼苗MDA含量達(dá)到最大值，與CK1相比顯著增加1.13倍(P＜0.05)。施加不同濃度MT后，MDA含量隨MT濃度的增加呈先下降后上升的趨勢，但均顯著低于CK2，在MT濃度為100 μmol/L(T2)時(shí)達(dá)到最小值，和CK2相比降低49.49%，與CK1無顯著差異(P＞0.05)。當(dāng)MT濃度高于100 μmol/L時(shí)，MDA含量逐漸升高，對Cr脅迫造成氧化損傷的緩解作用逐漸減弱。

圖2 外源MT對Cr脅迫下百日草幼苗MDA含量的影響

2.5 外源MT對Cr脅迫下百日草幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖3可以看出，與CK1相比，單一Cr脅迫處理(CK2)明顯降低了百日草幼苗的抗氧化酶活性，SOD和CAT活性分別降低16.71%和12.25%，差異顯著；POD活性降低16.71%，但差異不顯著。施加不同濃度MT后，與CK2相比，百日草幼苗SOD、POD和CAT活性顯著升高(P＜0.05)，且三種酶活性均在T2處理下達(dá)到最大值，分別升高43.89%、119.95%和65.49%；此后隨MT濃度繼續(xù)升高，抗氧化酶活性逐漸降低，高濃度MT(T5)作用下，SOD活性與CK1無顯著差異，而POD和CAT顯著高于CK1。

圖3 外源MT對Cr脅迫下百日草幼苗SOD(A)、POD(B)和CAT(C)活性的影響

3 討論與結(jié)論

Cr是一種重金屬污染物，高濃度Cr脅迫可以抑制植物細(xì)胞分裂，影響根系對有機(jī)物質(zhì)的吸收，導(dǎo)致植物葉片發(fā)黃，光合作用降低，生物量減少[17]。種子萌發(fā)時(shí)對Cr十分敏感，高濃度Cr脅迫會(huì)使植物種子內(nèi)糖和蛋白質(zhì)等生理代謝發(fā)生紊亂，活性氧增多，膜脂過氧化加重，種子萌發(fā)受到抑制[18]。MT作為一種重要的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠增強(qiáng)植物對干旱、高溫和重金屬等非生物脅迫的抗性[19]，促進(jìn)種子內(nèi)球蛋白和微管微絲的合成，增強(qiáng)乙醛酸循環(huán)中相關(guān)酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞分裂，并為種子萌發(fā)提供能量[20]。本研究中，100 μmol/L Cr脅迫下，百日草種子萌發(fā)受到顯著抑制，而施加50～400 μmol/L外源MT對百日草種子的萌發(fā)有明顯的促進(jìn)作用，且在100 μmol/L時(shí)緩解效果最優(yōu)；但當(dāng)MT濃度升高到600 μmol/L時(shí)促進(jìn)作用不明顯。這與黃益宗等[7]對水稻種子在As脅迫下施加MT的研究結(jié)果基本一致。

植物在重金屬脅迫下自身能發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)，組織細(xì)胞內(nèi)會(huì)合成和積累大量可溶性糖及可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以維持細(xì)胞內(nèi)的滲透勢[21]。唐懿等[22]研究表明，MT處理可顯著提高Cd脅迫下豌豆幼苗可溶性蛋白含量。本研究中，單一Cr脅迫下，百日草幼苗的可溶性糖和可溶性蛋白含量有所升高，可能是由于百日草為應(yīng)對脅迫啟動(dòng)了自我保護(hù)機(jī)制，促進(jìn)了可溶性糖的積累和蛋白質(zhì)的合成；施加不同濃度MT后，可溶性糖和可溶性蛋白含量進(jìn)一步顯著升高，說明MT增強(qiáng)了這種保護(hù)機(jī)制，并以100 μmol/L MT處理效果最佳。表明適宜濃度的MT處理可以通過提高可溶性糖和可溶性蛋白含量，維持細(xì)胞內(nèi)的滲透平衡，緩解Cr脅迫對百日草的傷害。

重金屬脅迫會(huì)抑制葉綠素酸酯還原酶的活性，破壞葉綠體膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致光合作用效率降低，植物生長受到影響[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，Cr脅迫下百日草幼苗的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均顯著降低，而施加不同濃度MT后均顯著升高。MT對Cr脅迫的緩解作用可能與其能防止葉綠素的降解有關(guān)[24]，也可能與其減弱了重金屬對葉綠素酸酯還原酶的抑制作用、為葉綠體膜結(jié)構(gòu)提供了保護(hù)、增強(qiáng)了有機(jī)物的吸收能力、活化了光合反應(yīng)相關(guān)酶類有關(guān)[22]。表明適宜濃度MT處理能夠提高百日草幼苗葉綠素的含量，從而減輕Cr脅迫的毒害，促進(jìn)植株正常生長。

植物處于重金屬脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除之間的平衡被打破，大量自由基積累會(huì)引起膜脂過氧化，MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，其含量高低表征膜脂過氧化程度[25]。植物體自身的SOD、POD和CAT等抗氧化保護(hù)酶類，能清除脅迫產(chǎn)生的活性氧，從而減輕植物受到的傷害[26]。本研究表明，Cr脅迫下，百日草幼苗的MDA顯著積累，而外源MT處理顯著抑制了MDA的積累，緩解了膜脂過氧化程度，維持了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，提高了對重金屬Cr脅迫的抵抗能力；50～400 μmol/L MT處理顯著提高了Cr脅迫下百日草幼苗的SOD、POD和CAT活性，并以100 μmol/L MT處理效果最佳。這與蔣航等[27]對水稻的研究結(jié)果大致相似。

綜上所述，100 μmol/L Cr處理對百日草種子萌發(fā)和幼苗生長造成了嚴(yán)重的抑制作用。適宜濃度的外源MT能夠通過增強(qiáng)百日草幼苗的抗氧化酶活性提高對活性氧和自由基的清除能力，降低膜脂過氧化對細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，有效抑制葉綠素降解酶活性，提高葉綠素含量，從而緩解重金屬鉻脅迫帶來的傷害，促進(jìn)百日草種子萌發(fā)及幼苗的生長，且以100 μmol/L MT處理緩解效果最佳。