喻望晨，朱依晗，徐 倩，劉寧芳，劉明稀，盧 蕊，胡龍興

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系, 湖南 長沙 410128）

土壤重金屬污染已成為影響人類社會可持續(xù)發(fā)展的重要生態(tài)和環(huán)境問題，其中鎘是污染最為嚴(yán)重的重金屬元素之一[1]。由于鎘對動植物具有極強(qiáng)的毒性，遷移性強(qiáng)、生物積累和放大效應(yīng)顯著等特點(diǎn)，能通過植物根部遷移到地上部進(jìn)而經(jīng)過食物鏈進(jìn)入人體器官，最終對人體健康造成危害[2]。因此，對鎘污染土壤的修復(fù)治理與安全利用已經(jīng)引起國內(nèi)外的廣泛重視。鎘污染土壤的修復(fù)技術(shù)可分為物理、化學(xué)、生物、聯(lián)合修復(fù)等多種方式[3]。相較而言，生物修復(fù)中的植物修復(fù)技術(shù)更加簡單，成本較低，并且經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益顯著[4]，受到廣泛認(rèn)可并得到很好的應(yīng)用。而對于植物修復(fù)而言，耐鎘和超富集鎘的植物品種的選育是基礎(chǔ)和關(guān)鍵[5-9]。

植物種子的萌發(fā)和幼苗生長是開展植物修復(fù)的關(guān)鍵開端，種子萌發(fā)期是植物對外界適應(yīng)的開始，也是對外界環(huán)境最敏感的時期之一。此外，因其操作簡便、可重復(fù)性強(qiáng)、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，在萌發(fā)期開展植物耐受重金屬能力的評價是國際上廣泛認(rèn)可的方法[10-12]。不同植物種類、品種或基因型間鎘脅迫對種子萌發(fā)期的影響存在較大差異。保瓊莉等[13]研究表明鎘脅迫對7 種苜蓿(Medicago sativa)種子萌發(fā)和幼苗生長的影響不同。王迪華等[14]研究表明鎘脅迫對小白菜(Brassica campestris)種子的萌發(fā)和生理特性造成不同程度的影響。黃娟等[15]在甜高粱(Sorghum bicolor‘Dochna’)種子萌發(fā)期的試驗表明，鎘脅迫對胚根長的抑制作用明顯大于胚芽長。

繁穗莧(Amaranthus cruentus)為莧科莧屬一年生糧食、飼料、蔬菜、觀賞等多種用途的農(nóng)作物。因其適應(yīng)性強(qiáng)、生長速度快、生物量大、根系發(fā)達(dá)，具有進(jìn)行重金屬污染土壤修復(fù)的潛力[16-17]。目前，對于不同地理來源繁穗莧種質(zhì)的耐鎘性評價研究還較為缺乏。因此，本研究以籽粒莧種質(zhì)創(chuàng)新課題組收集保存的16 份不同來源的繁穗莧種質(zhì)為試驗材料，在萌發(fā)期對其進(jìn)行耐鎘性鑒定和評價，以期篩選出耐鎘性強(qiáng)的種質(zhì)，為選育耐鎘繁穗莧新品種和豐富鎘污染土壤植物修復(fù)物種組成奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的繁穗莧種質(zhì)材料來自美國農(nóng)業(yè)部種質(zhì)資源庫(表1)，由籽粒莧種質(zhì)創(chuàng)新課題組擴(kuò)繁保存。其中重金屬鎘的供源為氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)，購自阿拉丁試劑官網(wǎng)(Aladdin)。

表1 繁穗莧種質(zhì)資源地理來源信息Table 1 Origin of A. cruentus germplasm resources

1.2 試驗設(shè)計與處理

試驗采用培養(yǎng)皿紙上發(fā)芽法。為了篩選合適的鎘濃度，以兩份繁穗莧種質(zhì)為試驗材料，通過預(yù)試驗設(shè)置0、40、80、120、160 μmol·L-15 個鎘濃度梯度，當(dāng)鎘濃度為80 μmol·L-1時繁穗莧的胚根長和胚芽長下降至對照組的一半。因此，本研究選擇80 μmol·L-1為鎘處理濃度。選取顆粒飽滿且無病蟲害的繁穗莧種子置于5%次氯酸鈉溶液中消毒5 min后，用無菌水沖洗3 次，晾干表面水分后，均勻播種于鋪有兩層無菌濾紙的玻璃培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中，培養(yǎng)皿中滴加80 μmol·L-1鎘溶液2 mL，對照組滴加相同體積的無菌水，每份種質(zhì)選取50 粒繁穗莧種子均勻放置于培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿置于25 ℃/20 ℃的人工氣候室，培養(yǎng)周期為光照14 h/黑暗10 h，每個處理3 次重復(fù)。每天用移液槍補(bǔ)加無菌水，保持濾紙濕潤。從種子置床之日起開始觀察，每天定時記錄每個培養(yǎng)皿內(nèi)種子萌發(fā)數(shù)量(當(dāng)胚芽達(dá)到種子長度一半或胚根達(dá)到種子長度記為發(fā)芽)，參照GB/T 2930.4-2017[18]于第4 天統(tǒng)計發(fā)芽勢，第 14天統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。試驗結(jié)束后測量幼苗的胚根長和胚芽長[19]。

1.3 測定項目與方法

在種子萌發(fā)過程中，以將種子放入人工培養(yǎng)箱后的24 h 為試驗的第1天，以連續(xù)3 d 種子發(fā)芽數(shù)不再增長作為試驗?zāi)┢诮Y(jié)束試驗(本試驗為發(fā)芽14 d結(jié)束)。在種子萌發(fā)1 d 后，持續(xù)觀察并記錄其發(fā)芽數(shù)[20]。以種子萌發(fā)的第4 天計算種子發(fā)芽勢，結(jié)束當(dāng)天在每個培養(yǎng)皿中隨機(jī)選擇10 株幼苗用游標(biāo)卡尺(精確到0.01 mm)測量胚根長、胚芽長，并統(tǒng)計分析各數(shù)據(jù)[21]。本試驗測定的指標(biāo)有發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚根長、胚芽長，并根據(jù)公式計算種子發(fā)芽指數(shù)和種子活力指數(shù)[22-23]。相關(guān)計算方法如下:

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理，運(yùn)用SPSS 22.0 軟件對相關(guān)發(fā)芽指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用Ducan’s 和獨(dú)立樣本T 檢驗法進(jìn)行差異顯著性檢驗。對每份種質(zhì)的相關(guān)發(fā)芽指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)值計算并求其平均值，以評價其耐鎘能力的強(qiáng)弱。

式中：i為每種參試植物；Xi為參試植物某一指標(biāo)的測定值；Xmax為所有試驗材料中某一指標(biāo)的最大值，Xmin為所有材料對應(yīng)指標(biāo)的最小值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫對不同繁穗莧種子萌發(fā)的影響

鎘脅迫下，16 份繁穗莧種質(zhì)均表現(xiàn)出較高的發(fā)芽勢和發(fā)芽率，與對照處理均無顯著差異(P＞ 0.05)(表2)。并且鎘脅迫下，16 份繁穗莧種子的發(fā)芽勢均大于94%，其發(fā)芽率均大于96%；同時其相對發(fā)芽勢均大于94%，相對發(fā)芽率均大于96%，表明繁穗莧種子的耐鎘性均較強(qiáng)。

表2 鎘脅迫對不同繁穗莧種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響Table 2 Effect of cadmium stress on germination vigor and germination rate of A. cruentus

2.2 鎘脅迫對不同繁穗莧種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

16 份繁穗莧種子的發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢、發(fā)芽率呈現(xiàn)相同的趨勢，其發(fā)芽指數(shù)均大于20，其相對發(fā)芽指數(shù)均大于85%，其中K112、K472、Ace655、Ace689相對發(fā)芽指數(shù)小于95% (表3)。

發(fā)芽指數(shù)在鎘脅迫處理下均無明顯下降，同時不同種質(zhì)的發(fā)芽指數(shù)下降幅度無明顯差異，表明在鎘脅迫處理下對繁穗莧種子的萌發(fā)影響較小(表3)。其中在鎘脅迫處理條件下，Ace621 相較于對照組有顯著促進(jìn)萌發(fā)的效果(P＜ 0.05)。除K112、Ace613、Ace689 種子的活力指數(shù)下降幅度在65%以下，其余種子的活力指數(shù)下降幅度均在65%以上，其中Ace628 活力指數(shù)下降幅度最高達(dá)到74.56%。且分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽指數(shù)較低的種質(zhì)往往其活力指數(shù)也較低。

表3 鎘脅迫對16 份不同繁穗莧種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響Table 3 Effects of cadmium concentration on germination index and vigor index of A. cruentus

2.3 鎘脅迫對不同繁穗莧幼苗生長情況的影響

鎘脅迫下繁穗莧的胚根生長受到顯著抑制(表4)，而胚芽生長抑制程度較小，這主要是由于根系作為直接吸收重金屬離子的部位，重金屬離子抑制根尖細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，進(jìn)而使根系生長受到明顯抑制。其中Ace689 和R104 的胚根長受到的抑制作用較其他種質(zhì)較小，相對胚根長分別為41.60%和41.07%；Ace651、Ace568、Ace628、Ace631 等種質(zhì)的胚根長受到的抑制作用較其他種質(zhì)顯著，其相對胚根長均在25%左右。不同種質(zhì)的胚芽長受到鎘脅迫的抑制程度較小，但是不同種質(zhì)的相對胚芽長差異較顯著；其中R104 相對胚芽長的值最大，達(dá)到101.72%；Ace575 的相對胚芽長最小為58.31%?？傮w來看，大部分試驗材料的相對胚根長在25%～30%，相對胚芽長在60%以上；在鎘脅迫條件下繁穗莧種子的根系受抑制程度比芽受抑制的程度更強(qiáng)。

表4 鎘脅迫對16 份不同繁穗莧胚根長和胚芽長的影響Table 4 Effects of cadmium concentration on radicle length and germ length of A. cruentus

2.4 鎘脅迫對不同繁穗莧種子萌發(fā)期影響的綜合評價

為了綜合評價16 份繁穗莧試驗材料的耐鎘性，本研究采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法，對16 份種子萌發(fā)期的相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽指數(shù)、相對胚根長、相對胚芽長、相對活力指數(shù)進(jìn)行隸屬函數(shù)值計算(表5)。結(jié)果顯示，16 份種質(zhì)種子萌發(fā)期對于耐鎘脅迫能力依次表現(xiàn)為R104 ＞ Ace613 ＞Ace621 ＞ Ace651 ＞ Ace671 ＞ Ace689 ＞ Ace568 ＞Ace666 ＞ Ace650 ＞ Ace631 ＞ Ace628 ＞ K472 ＞Ace655 ＞ Ace617 ＞ K112 ＞ Ace575。

表5 繁穗莧萌發(fā)期耐鎘性隸屬函數(shù)及排序Table 5 Membership function and ranking of cadmium tolerance of A. cruentus during germination

采用離差平方和法(ward 法)，對16 份繁穗莧種質(zhì)資源在鎘脅迫處理下種子萌發(fā)期各性狀指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析(圖1)。將耐受能力相近的種質(zhì)劃分為同一類別，當(dāng)歐式距離為5 時，可將繁穗莧分為3 大類，第Ⅰ類為敏感型，包括Ace655、Ace631、Ace628、Ace617、Ace575、Ace650、K472、K112；第Ⅱ類為耐鎘型，包括Ace671、Ace689、Ace568、Ace666、Ace621、Ace651、Ace613；第Ⅲ類為極端耐鎘型R104，該類繁穗莧種質(zhì)資源占供試材料的6.25%。

圖1 16 份繁穗莧種質(zhì)耐鎘性的聚類分析Figure 1 Cluster analysis of cadmium tolerance of 16 A. cruentus germplasm resources

3 討論

鎘對動植物來說是一種劇毒的重金屬，會嚴(yán)重污染土壤環(huán)境和危害動植物的生命健康，而采用植物修復(fù)重金屬污染土壤是一個切實(shí)可行的辦法[24]，其成本較低并且還可以帶來一定的經(jīng)濟(jì)效益。許多超富集植物存在耐受性單一、生長速度慢、生物量低等限制，導(dǎo)致其修復(fù)污染土壤的時間長、效率低，而繁穗莧適應(yīng)性強(qiáng)、生長速度快、生物量大、根系發(fā)達(dá)，因此選育耐鎘和超富集鎘的繁穗莧品種對鎘污染土壤修復(fù)具有重要意義。

種子萌發(fā)期的相關(guān)生長指標(biāo)能夠反映植物耐鎘能力的強(qiáng)弱，在本研究中選定了發(fā)芽率等6 個指標(biāo)對16 份繁穗莧種子的耐鎘能力進(jìn)行綜合評價。胡娜等[25]研究指出，較低濃度的重金屬脅迫處理會促進(jìn)鹽生草種子的萌發(fā)，而較高濃度的重金屬脅迫處理則會抑制種子的萌發(fā)。本研究表明在鎘濃度為80 μmol·L-1的處理下，除耐鎘型繁穗莧種質(zhì)Ace621 處理組發(fā)芽指數(shù)顯著高于對照組發(fā)芽指數(shù)外，鎘脅迫對其他種子的萌發(fā)則無顯著效果或呈現(xiàn)輕微抑制效果。此外，敏感型繁穗莧種質(zhì)相對發(fā)芽指數(shù)均小于100%，耐鎘型和極端耐鎘型種質(zhì)相對發(fā)芽指數(shù)則明顯高于敏感型種質(zhì)。大部分敏感型繁穗莧種質(zhì)相對胚根長均小于29%，大部分耐鎘型種質(zhì)相對胚根長則大于29%，其中Ace689 為41.60%，極端耐鎘型種質(zhì)R104 相對胚根長為41.07%。鎘濃度為80 μmol·L-1對供試種子的萌發(fā)和發(fā)芽指數(shù)抑制作用小于根系生長和活力指數(shù)，并且種子幼苗的胚根長生長受到了明顯抑制，推測此結(jié)果出現(xiàn)的原因是根系作為直接吸收重金屬離子的部位，重金屬離子抑制根尖細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，進(jìn)而使根系生長受到明顯抑制[26]。胚芽長受到的抑制作用較小，但是不同種質(zhì)間差異顯著。

評價不同種子萌發(fā)期耐鎘能力的高低不能簡單地使用一個指標(biāo)，應(yīng)該采用多項指標(biāo)綜合評價其耐鎘能力以減少誤差。因此，本研究采用模糊隸屬函數(shù)等分析方法選取鎘脅迫條件下6 項生長指標(biāo)的變化來評價不同繁穗莧種子耐鎘能力的強(qiáng)弱，使分析結(jié)果更加可信。綜合分析繁穗莧在鎘脅迫下所得到的各項萌發(fā)與生長指標(biāo)，認(rèn)為其雖然受到一定的抑制作用，但是其在鎘濃度80 μmol·L-1的處理下仍能正常萌發(fā)和生長，對鎘脅迫有一定的耐受能力。因此認(rèn)為繁穗莧可以作為土壤鎘污染修復(fù)的潛在植物。

4 結(jié)論

繁穗莧表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鎘性，在80 μmol·L-1鎘脅迫處理下，其發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)仍較高，但是其胚根長和活力指數(shù)受到顯著影響。通過聚類分析和模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對6 項生長指標(biāo)的變化綜合分析表明，R104 種質(zhì)具有極強(qiáng)的耐鎘性。