陸忠杰，楊正禹，羅 奔，李 舟，董 瑞

（1. 涼州區(qū)農(nóng)業(yè)技術推廣中心，甘肅 武威 733000；2. 貴州大學動物科學學院, 貴州 貴陽 550025）

箭筈豌豆(Vicia sativa)是野豌豆屬中重要的一年生、二倍體、自花授粉豆科植物[1]，具有生育周期短、適應性強、兼固氮及改善土壤結構的能力，是一種重要的飼草和綠肥兼用類作物。在中國、土耳其、新西蘭等國廣泛種植[2-4]，在我國普遍種植于華北、西北以及長江中下游等高海拔地區(qū)[5]。

野豌豆屬植物全球約有190 多個物種[6]，其中在歐洲、高加索地區(qū)以及中國分布的種類最多，是該屬植物的3 個現(xiàn)代分布中心[7]。Ball[8]首次將野豌豆屬植物劃分為Vicia、Cracca、Ervum和Faba4 個亞屬。Maxted[9]在表型分類的基礎上又將亞屬細分為9 大系列，38 個種，14 個亞種。我國有野豌豆屬植物43 種，其中栽培種類5 種，野生種類36 種(其中兩個被合并)[10]。

種質(zhì)資源是作物育種的重要物質(zhì)基礎，在開發(fā)新的優(yōu)良作物栽培品種方面發(fā)揮著重要的作用[11]。箭筈豌豆遺傳多樣性可為該種的改良以及選育提供遺傳基礎。對大量種質(zhì)多種性狀進行比較篩選，發(fā)現(xiàn)特異性高且可用性強的遺傳變異性狀，是種質(zhì)改良的常用手段。王鵬等[12]對30 份不同來源的大豆(Glycine max)種質(zhì)的17 個主要農(nóng)藝性狀進行分析，篩選出了‘晉豆39’和‘中作966’兩種農(nóng)藝性狀表現(xiàn)突出的種質(zhì)。梁國玲等[13]對590 份燕麥(Avena sativa)種質(zhì)的穗部進行遺傳多樣性分析，篩選出了117 份種質(zhì)作為糧飼兼用型育種目標親本。陳柳宏等[14]對東北地區(qū)的205 份甜菜(Beta vulgaris)的5 個品質(zhì)性狀、18 個農(nóng)藝性狀以及3 個抗性性狀分別進行遺傳多樣性分析，篩選出 5 份高抗褐斑病兼抗根腐病種質(zhì)，可作為抗病育種的優(yōu)質(zhì)親本進行改良選育。

種子的形態(tài)多樣性變異是植物遺傳變異的重要特征之一，在遺傳分類學上具有重要研究價值[15]，可作為種內(nèi)及種間的分類依據(jù)，以及用來鑒定某一特異性品種[16]。種子形態(tài)性狀還可作為作物改良計劃中的選擇標準[17-18]，還是識別種子的重要依據(jù)，其與種子的繁衍能力、種子的萌發(fā)、幼苗建植和存活，甚至種群的分布格局密切相關[19]。且牧草種子的形態(tài)特征是對其進行分級和檢驗的重要手段，是研究各種牧草種子真實性以及純度鑒定的主要依據(jù)[20]。種子的形態(tài)特征與其他植物器官相比，以種子作為試驗材料來研究物種的遺傳多樣性具有操作方便、易收集且易儲存等眾多優(yōu)點[21]。周生壇等[22]對251 份鷹嘴豆(Cicer arietinum)的11 個種子表型性狀數(shù)據(jù)進行綜合分析，為鷹嘴豆優(yōu)異基因發(fā)掘、育種改良以及種質(zhì)創(chuàng)新提供了理論依據(jù)。郭宇琦等[23]對104 份北方春大豆地方品種的10 個種子活力相關的性狀進行測定，篩選出了‘保險豆’、‘湯原禿莢子’等8 個高活力地方品種，可作為培育高活力品種的親本材料。

然而，我國對箭筈豌豆種子形態(tài)性狀的遺傳變異研究較少。這對于選育具有較強環(huán)境適應性、較高抗逆性且種植范圍較廣的箭筈豌豆品種造成了極大的不便。因此本研究選用廣泛分布于世界各地的12 份V.sativa和63 份V.sativasubsp.nigra亞種，共75 份箭筈豌豆種質(zhì)作為試驗材料。通過對各個種質(zhì)的9 個種子性狀進行分析，并估計關鍵性狀的基因型變異，旨在篩選出具有優(yōu)良的種子形態(tài)特征的種質(zhì)，為箭筈豌豆的新品種的選育以及種質(zhì)鑒定提供有價值的數(shù)據(jù)和材料基礎。

1 材料與方法

1.1 種質(zhì)來源

75 份箭筈豌豆種質(zhì)分別為12 份箭筈豌豆和63份箭筈豌豆亞種。75 份種質(zhì)種子分別由美國種質(zhì)資源庫(National Plant Germplasm System of the United States, NPGS)和蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院提供，將蘭州大學選育的‘蘭箭1 號’、‘蘭箭2 號’、‘蘭箭3 號’箭筈豌豆本地栽培品種作為對照。種質(zhì)詳細信息如表1 所列。

表1 75 份箭筈豌豆種質(zhì)信息Table 1 Information of 75 common vetch accessions

1.2 試驗地概況

試驗地點位于貴州省貴陽市花溪區(qū)貴州大學實驗田(106°07′ E，26°11′ N，海拔1 100 m)，地處貴州高原中部。該區(qū)具有明顯的高原氣候特點，屬于亞熱帶濕潤溫和型氣候。年平均氣溫14.8 ℃，年均降水量1 347.3 mm。

1.3 試驗設計

試驗共進行8 個月，從2020 年10 月到2021 年5 月。每個種質(zhì)每個重復種植10 個單株，3 個重復，每個種質(zhì)的一個重復種植在同一個花盆內(nèi)。用貴州本地普通黃壤土過篩(2 mm)后作為種植土壤，每盆裝土約5 kg，花盆大小為35 cm (高) × 22 cm (底徑)。

1.4 測定項目及其方法

在2021 年3 月至5 月種植期間內(nèi)，根據(jù)不同種

質(zhì)種子的成熟時間，對種子進行分批次收集。將收集到的種子進行烘干，使其含水量保持在9%～10%，然后在4 ℃ 條件下進行儲存，于每份種質(zhì)每個重復中隨機挑選50 粒種子作為待測樣品。

本研究中共測定了9 個種子性狀，分別為種子長(SL)、寬(SW)、周長(Pe)、厚度(ST)、彎曲長度(CL)、彎曲寬度(CW)、種臍長(HL)、百粒重(WS)和形狀。種子形狀示意圖如圖1 A 所示。

圖1 種子形狀和種子長、寬等性狀測量位置示意圖Figure 1 Schematic diagram of the measurement position of seed shape, seed length, and width

對種子長、寬、周長、厚度、彎曲長度、彎曲寬度5 項指標進行測量時，首次使用平板掃描儀(Epson Perfection V800 Photo)對每份種質(zhì)每個重復的50 粒待測種子樣品進行掃描，掃描圖片的規(guī)格為350 dpi的圖像分辨率以及2 040 × 2 040 Px 的像素。在掃描期間為防止種子的大小、形狀以及重量等性狀發(fā)生變化，實驗室的溫度和相對濕度應保持在20 ℃和15%。最后通過WinRHIZO 圖像分析系統(tǒng)(加拿大)對掃描圖像進行處理，并得到相應數(shù)據(jù)。種子厚和種臍長度用游標卡尺進行測量，百粒重則使用萬分之一天平進行稱量，詳細測量方法見文獻[24]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析基于：1)進行方差分析以評估各種質(zhì)間基因型變異的顯著性和大小。2)模式分析，包括聚類分析和主成分分析(principal component analysis,PCA)[25-27]，以圖形方式對按性狀收集的數(shù)據(jù)矩陣進行了總結，其中聚類分析通過K-means 聚類法(stats 包)完成。

使用GenStat 7.1 (2003)中的“殘差最大似然”(residual maximum likelihood，REML)選項進行方差分量分析。隨機線性模型用于分析亞種中不同種質(zhì)的數(shù)據(jù)。詳細數(shù)據(jù)分析方法見Dong 等[28]的文章。

2 結果與分析

12 份箭筈豌豆和63 份箭筈豌豆亞種種質(zhì)之間除形狀外的8 個種子性狀均存在顯著的基因型變異(P＜ 0.05) (表2)。根據(jù)平均重復值(R)可判斷各表型性狀的遺傳穩(wěn)定性。12 份箭筈豌豆和63 份箭筈豌豆亞種的種子長、寬、周長、彎曲長度以及彎曲寬度具有較為相似的R估計值，均大于0.964。且性狀彎曲寬度在箭筈豌豆和箭筈豌豆亞種中具有最高的R估計值，分別為0.981 和0.965，而性狀種臍長則在箭筈豌豆和箭筈豌豆亞種中具有最低的R估計值，分別為0.972 和0.798 (表2)。對8 個種子性狀均值分析發(fā)現(xiàn)，箭筈豌豆和箭筈豌豆亞種之間，8 個性狀均存在顯著差異(P＜ 0.05) (表2)。

表2 箭筈豌豆種質(zhì)內(nèi)估計基因型( )、試驗誤差()方差分量及相關標準誤差( ± SE)評估Table 2 Estimated genotype ( ) , experimental error (), variance component, and related standard error ( ± SE)evaluation from 12 Vicia sativa and 63 V. sativa subsp. nigra accessions

表2 箭筈豌豆種質(zhì)內(nèi)估計基因型( )、試驗誤差()方差分量及相關標準誤差( ± SE)評估Table 2 Estimated genotype ( ) , experimental error (), variance component, and related standard error ( ± SE)evaluation from 12 Vicia sativa and 63 V. sativa subsp. nigra accessions

加粗的平均值代表箭筈豌豆和箭筈豌豆亞種間存在顯著差異(P ＜ 0.05)。Means in bold represent significant differences between the common vetch and common vetch subspecies (P ＜ 0.05).

指標 Index種質(zhì)Germplasm項目Item 長Length/mm寬Width/mm周長Perimeter/mm彎曲長度Curved length/mm彎曲寬度Curved width/mm厚度Thickness/mm種臍長Hilum length/mm百粒重100-seed weight/g平均值Average value最大值Maximum 4.44 4.23 13.74 6.96 6.64 3.44 2.14 4.47 5.45 5.42 17.22 8.56 8.51 4.31 2.92 8.21最小值Minimum 2.88 2.79 8.78 4.51 4.39 2.38 1.43 1.57 LSD0.05 0.045 0.026 0.046 0.004 0.038 0.024 0.033 0.007箭筈豌豆Vicia sativa σ2g估計基因型( )Estimated genotype 0.604 ± 0.263 0.565 ± 0.245 6.133 ± 2.668 1.490 ± 0.649 1.392 ± 0.605 0.273 ± 0.120 0.160 ± 0.071 3.779 ± 1.633 σ2ε試驗誤差( )Test error 0.039 ± 0.012 0.033 ± 0.010 0.371 ± 0.112 0.096 ± 0.029 0.080 ± 0.024 0.064 ± 0.010 0.047 ± 0.007 0.150 ± 0.045平均重復值(R)Average repeat value 0.979 0.981 0.980 0.979 0.981 0.977 0.972 0.987平均值Average value最大值Maximum 3.25 3.15 10.04 5.11 4.95 2.93 1.73 2.09 4.45 4.38 13.96 6.99 6.87 4.15 2.68 6.96最小值Minimum箭筈豌豆亞種Vicia sativa subsp. nigra 2.25 2.22 6.84 3.54 3.48 1.91 1.01 0.69 LSD0.05 0.011 0.026 0.018 0.005 0.039 0.035 0.020 0.022 σ2g估計基因型( )Estimated genotype 0.223 ± 0.042 0.206 ± 0.038 2.241 ± 0.418 0.551 ± 0.103 0.508 ± 0.094 0.142 ± 0.039 0.031 ± 0.006 0.840 ± 0.162 σ2ε試驗誤差( )Test error平均重復值(R)Average repeat value 0.024 ± 0.003 0.022 ± 0.002 0.25 ± 0.032 0.060 ± 0.008 0.055 ± 0.007 0.096 ± 0.008 0.078 ± 0.012 0.177 ± 0.022 0.965 0.965 0.964 0.965 0.965 0.937 0.798 0.934

通過對種子形狀的分析發(fā)現(xiàn)，種子形狀在12 份箭筈豌豆和63 份箭筈豌豆亞種中的變異相對較低。除了在63 份箭筈豌豆亞種中有20 份橢圓形種子的種質(zhì)以及方形、不規(guī)則形種子種質(zhì)各1 份外，其余種質(zhì)種子均為圓形種子。

2.1 12 份箭筈豌豆種質(zhì)種子形態(tài)特征模式分析及表型相關性

主成分分析和聚類分析結合的模式分析主要通過圖形化匯總形式分析和比較75 份箭筈豌豆各種質(zhì)種子性狀之間的差異，同時還能直觀地表現(xiàn)出性狀之間的關聯(lián)信息(正相關性或負相關性)[30]。其中，各性狀之間的相關性由方向向量表示，不同符號則表示聚類分析產(chǎn)生的不同分組。對12 份箭筈豌豆種質(zhì)進行模式分析，第1 主成分解釋了總體性狀變異的94.82%，第2 主成分解釋了2.8%(圖2)。在12 份箭筈豌豆亞種種質(zhì)中，8 個種子性狀兩兩性狀之間呈現(xiàn)極顯著(P＜ 0.01)正相關關系(方向向量之間的角度 ＜ 90°) (圖2)。

在模式分析中，根據(jù)8 個種子性狀將12 份箭筈豌豆種質(zhì)進行聚類分析，可將其分為兩個群組(圖2)，其中第Ⅰ組群種質(zhì)的種子長、寬、周長、彎曲長度、彎曲寬度、厚度、種臍長以及百粒重8 個性狀的平均值均高于第Ⅱ組群種質(zhì)的平均值(表3)。其中，蘭箭1 號、2 號、3 號和67 號4 個種質(zhì)為第Ⅰ組群種質(zhì)，8 個種質(zhì)為第Ⅱ組群。

表3 12 份箭筈豌豆種質(zhì)聚類分析產(chǎn)生的兩個種群各定量性狀均值Table 3 The mean values of each quantitative trait of 2 groups from the cluster analysis of 12 Vicia sativa accessions

表4 中所示的表型相關系數(shù)(rp)進一步驗證了圖2 中所示的性狀種子長、寬、周長、彎曲長度、彎曲寬度、厚度、種臍長以及百粒重8 個性狀之間具有極顯著正相關性。其中，最小值為厚度和種子長以及厚度和彎曲長度之間的0.854，最高值則為種子長和彎曲長度之間的0.999。

圖2 12 份箭筈豌豆種質(zhì)8 個種子性狀的模式分析Figure 2 Model analysis of 8 seed traits of 12 Vicia sativa accessions

表4 12 份箭筈豌豆種質(zhì)各性狀之間的表型(rp)相關系數(shù)Table 4 Phenotypic (rp) correlation coefficients between the traits of 12 Vicia sativa accessions

2.2 63 份箭筈豌豆亞種種子形態(tài)特征模式分析及表型相關性

63 份箭筈豌豆亞種種質(zhì)基于種子長、寬、周長、彎曲長度、彎曲寬度、厚度、種臍長以及百粒重8 個性狀的模式分析結果表明，第1 主成分解釋了總體性狀變異的84.0%，第2 主成分解釋了9.1%(圖3)。在63 份箭筈豌豆亞種種質(zhì)中，8 個種子性狀兩兩之間呈現(xiàn)極顯著(P＜ 0.01)正相關關系(圖3)。

同時，基于種子長、寬、周長、彎曲長度、彎曲寬度、厚度、種臍長以及百粒重 8 個性狀對63 份箭筈豌豆亞種種質(zhì)進行聚類分析，可將其分為3 類(表5)。其中第Ⅰ組群包含的種質(zhì)最多，達33 份種質(zhì)；第Ⅱ組群次之，有16 份種質(zhì)；第Ⅲ組群包含的種質(zhì)最少，只有14 份種質(zhì)(表5)。同時，第Ⅱ組群中8 個性狀的平均值均高于其余組群的平均值。而在第Ⅲ組群中，8 個性狀的平均值均低于其余群組的平均值(表5)。

表5 63 份箭筈豌豆亞種種質(zhì)聚類分析產(chǎn)生的3 個種群各定量性狀均值Table 5 The mean values of quantitative traits of 3 groups generated by cluster analysis of 63 Vicia sativa subsp. nigra accessions

表型相關系數(shù)(rp)進一步驗證了圖3 中所示的性狀種子長、寬、周長、彎曲長度、彎曲寬度、厚度、種臍長以及百粒重之間的相關性(表6)。性狀種子長、寬、周長、彎曲長度、彎曲寬度、厚度以及百粒重的所有成對組合的rp值均極顯著(P＜ 0.01)正相關，其中，最小值為種子長和百粒重之間的相關系數(shù)0.759，最高值則為種子寬和彎曲寬度之間的相關系數(shù)為0.999。種臍長和其余7 種性狀之間的rp值則略低，但也存在極顯著的正相關關系(表6)。

表6 63 份箭筈豌豆亞種種質(zhì)各性狀之間的表型(rp)相關系數(shù)Table 6 Phenotypic (rp) correlation coefficients among the traits of 63 Vicia sativa subsp. nigra accessions

圖3 63 份箭筈豌豆亞種種質(zhì)8 個種子性狀的模式分析Figure 3 Model analysis of 8 seed traits of 63 Vicia sativa subsp. nigra accessions

3 討論

在本研究中，12 份箭筈豌豆以及63 份箭筈豌豆亞種之間，8 個種子性狀種子長、寬、周長、彎曲長度、彎曲寬度、厚度、種臍長以及百粒重均存在顯著(P＜ 0.05)的基因型變異。這些種子性狀的基因型變異和平均重復性(R)估計值表明，在所試的75 份箭筈豌豆種質(zhì)內(nèi)均有潛在可用的遺傳變異。種子長、種子寬以及百粒重的變化范圍在12 份箭筈豌豆以及63 份箭筈豌豆亞種中分別為2.88～5.45 和2.25～4.45 mm、2.79～5.42 和2.22～4.38 mm、1.57～8.21 和0.69～6.96 g。同時本研究發(fā)現(xiàn)，所試的12 份箭筈豌豆各種質(zhì)8 個性狀的平均值都大于63 份箭筈豌豆亞種的(表2)。且對12 個箭筈豌豆種質(zhì)聚類發(fā)現(xiàn)，67 號這一種質(zhì)與蘭箭系列的3 個種質(zhì)被分在8 個性狀均較高的一組(圖2)。因此，本研究認為67 號這一種質(zhì)的種子形態(tài)多樣性對于種質(zhì)的遺傳改良具有重要意義。

這些與種子大小相關的性狀可作為種質(zhì)種植前期的篩選標準，這對于幼苗的建植和存活是十分重要的。Moles[31]的研究發(fā)現(xiàn)，種子的大小在種質(zhì)的后期生長發(fā)育過程中各有特點。與大種子相比，小種子種質(zhì)在受到同樣的外界能量下可以產(chǎn)生更多的種子，可用于種子生產(chǎn)。而大種子種質(zhì)應對環(huán)境變化而產(chǎn)生的脅迫能力更強。因此，研究認為在生長環(huán)境一定時，不同大小的種子對其種質(zhì)幼苗的建植、存活以及生長發(fā)育具有顯著影響。李振聲[32]研究發(fā)現(xiàn)種子粒重是決定作物產(chǎn)量的重要因素，其受環(huán)境條件的影響相對較小，對種子產(chǎn)量的直接貢獻最大，通過對種子百粒重的選擇可以提高產(chǎn)量。因此本研究對種子種質(zhì)資源進行評價，得到關鍵種子遺傳性狀的數(shù)據(jù)是選育新品種的重要依據(jù)，尤其是對種子生產(chǎn)以及幼苗的建植、存活以及生長發(fā)育的改良具有十分重要的意義。在本研究中，12 份箭筈豌豆以及63 份箭筈豌豆亞種各種質(zhì)間的種子長、寬以及百粒重都存在著顯著的差異(P＜ 0.05)，其中在12 份箭筈豌豆內(nèi)種子長和百粒重最大的種質(zhì)都是蘭箭1 號(5.45 mm, 8.21 g)，種子寬最大的種質(zhì)則是蘭箭2 號(5.42 mm)，而種子長、寬以及百粒重3個性狀最小的種質(zhì)則都是64 號(2.88 mm, 2.79 mm,1.57 g)。在63 份箭筈豌豆亞種內(nèi)種子長、寬以及百粒重最大的種質(zhì)分別為14 號(4.45 mm)、12 號(4.38 mm)和20 號(6.96 g)種質(zhì)，而種子長、寬以及百粒重3 個性狀最小的種質(zhì)則都是57 號(2.25 mm, 2.22 mm,0.69 g) (表2)。因此，本研究中，64 號、57 號、20 號等種質(zhì)可為箭筈豌豆種子大小改良提供育種材料和一定數(shù)據(jù)基礎。目前，箭筈豌豆主要種植于我國青藏高原等高海拔地區(qū)，是該地區(qū)的主要牧草和綠肥作物。但是，這些地區(qū)往往環(huán)境惡劣，生長季較短。因此，該地區(qū)種植大種子箭筈豌豆種質(zhì)有利于其幼苗的建植和存活。

根據(jù)植物的性狀指標對植物進行聚類分析，在種質(zhì)鑒定、篩選以及探究其親緣關系等方面是常用且有效的方法。韓梅等[33]根據(jù)9 個產(chǎn)量性狀對124份箭筈豌豆進行聚類分析，可將其聚為5 類。白金順等[34]根據(jù)11 項抗旱指標對14 份箭筈豌豆進行聚類分析，將其聚為4 類。在該研究中，12 份箭筈豌豆以及63 份箭筈豌豆亞種的8 個種子性狀均具有顯著(P＜ 0.05)的基因型變異估計值，而兩個亞種之間單個性狀平均值的比較也呈現(xiàn)顯著(P＜ 0.05)的差異(表2)。因此，本研究根據(jù)上述8 個種子性狀分別將12 份箭筈豌豆種質(zhì)和63 份箭筈豌豆亞種種質(zhì)分為2 組和3 組(圖2、圖3)，分類清晰且明確。綜上所述，本研究認為在箭筈豌豆和箭筈豌豆之間具有顯著(P＜ 0.05)差異的性狀可用于箭筈豌豆分類學關系的研究。

目前，已有許多學者利用模式分析來識別育種研究中的重要植物材料。例如Jahufer 等[35]、Zhang 等[36]和Harch 等[37]分別在白三葉草(Trifolium repens)、 春小麥(Triticum aestivum)和花生(Arachis hypogaea)中均利用模式分析對育種材料進行了分析和研究。本研究對12 份箭筈豌豆種質(zhì)以及63 份箭筈豌豆亞種種質(zhì)進行模式分析，探究了其中在種子性狀方面有價值和潛力的種質(zhì)群體，而這些種質(zhì)群體內(nèi)的種質(zhì)資源所蘊含的遺傳多樣性，對種子形態(tài)特征相關的分類學和育種研究具有十分重要的意義。

4 結論

本研究對75 份箭筈豌豆種質(zhì)的種子性狀進行以主成分和聚類分析相結合的模式分析、基因型變異分析和相關性分析，結果發(fā)現(xiàn)，在75 份種質(zhì)除形狀外的其他8 個種子性狀均表現(xiàn)出兩兩呈極顯著正相關關系(P＜ 0.01)，且8 個種子性狀均呈顯著的(P＜ 0.05)基因型變異估計值。同時，通過對亞種內(nèi)各種質(zhì)單個性狀平均值的比較也發(fā)現(xiàn)其具有顯著差異(P＜ 0.05)。且根據(jù)8 個種子性狀能清晰且明確的分別將12 份箭筈豌豆以及63 份箭筈豌豆亞種種質(zhì)分別分為2 組和3 組。因此，本研究認為以上8 個種子性狀均可以作為V. sativa和V. sativasubsp.nigra亞種種質(zhì)之間進行分類的指標，且具有優(yōu)良性狀的種質(zhì)也可以作為育種和品種改良的基礎材料。