白 萍 李巧云

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院婦科，河南鄭州 450000

目前，宮頸癌位居女性因癌癥死亡的第4 位。在我國(guó)，宮頸癌已成為威脅女性健康的第二大惡性腫瘤，具有發(fā)病年齡年輕化且發(fā)病率逐步上升的特點(diǎn)。宮頸液基薄層細(xì)胞（thinprep cytologic，TCT）檢測(cè)是篩查宮頸癌及高級(jí)別病變的主要方法，其中，對(duì)于非典型鱗狀細(xì)胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASCUS）的診治目前仍然存在爭(zhēng)議。ASCUS 患者的細(xì)胞學(xué)特征為雖存在鱗狀上皮的異常，但診斷為上皮內(nèi)病變的證據(jù)不足，因此，其組織病理學(xué)的差異很大。目前主要是根據(jù)人乳頭瘤病毒（human papillionma virus，HPV）DNA 的結(jié)果進(jìn)行ASCUS 患者的分流，由于HPV DNA 存在假陽(yáng)性率高及特異性低等問(wèn)題，使得該類患者的陰道鏡轉(zhuǎn)診率及活檢率居高不下，造成了過(guò)度治療，增加了患者的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。E6 基因通過(guò)掌握細(xì)胞周期位點(diǎn)，允許病毒DNA 進(jìn)行非循環(huán)復(fù)制；E7 基因主要是掌控細(xì)胞周期G1、S 期，在病毒擴(kuò)增階段，病毒拷貝數(shù)擴(kuò)增，E6 及E7 基因表達(dá)的mRNA 可以被有效檢測(cè)出來(lái)。因此，HPV E6/E7 mRNA 有望成為目前最有希望的宮頸癌標(biāo)志物。本研究選取了198例經(jīng)TCT 篩查結(jié)果為ASCUS 患者，對(duì)其高危型HPV感染情況、HPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)及宮頸病變分級(jí)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析，旨在探討HPVE6/ E7mRNA對(duì)ASCUS 患者的分流及疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020 年3 月至2022 年3 月就診于鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院婦科門診經(jīng)TCT 檢驗(yàn)結(jié)果為ASCUS 患者 198 例，病理診斷醫(yī)師依據(jù)國(guó)際 TBS（the Bethesda）分類標(biāo)準(zhǔn)做出診斷。年齡19～63 歲，平均（38.9±7.2）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①在鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院經(jīng)TCT 檢查初次發(fā)現(xiàn)為ASCUS；②性接觸史≥3 年且目前未妊娠及哺乳期女性；③檢查前24h內(nèi)無(wú)性生活史、72h 內(nèi)無(wú)陰道灌洗上藥史；④無(wú)宮頸相關(guān)操作及治療史，無(wú)其他惡性疾病及放化療病史。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：Y2021014），且所有患者均知曉宮頸癌篩查方法且簽署相關(guān)知情同意后行陰道鏡及活檢。對(duì)其中活檢病理為高度鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）的患者統(tǒng)計(jì)HPV DNA 及HPV E6/E7 mRNA 這2 種檢測(cè)方法對(duì)HSIL+的檢出率、診斷效能及ROC 曲線的曲線下面積（area under the curve，AUC）值并進(jìn)行分析；對(duì)于活檢病理為HSIL-且未行相關(guān)治療的95例患者隨訪1年，行ROC曲線分析2 種檢測(cè)方法對(duì)疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)效能。

1.2 方法

1.2.1 宮頸脫落細(xì)胞采集與讀片 ①TCT：按照TCT使用說(shuō)明書(shū)收集宮頸脫落細(xì)胞，標(biāo)本采集后放入細(xì)胞保存液（寧波美生醫(yī)療器械有限公司），由醫(yī)院兩位病理科醫(yī)師在顯微鏡下按照TBS 標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告結(jié)果。②高危HPV DNA 檢測(cè)：采用杭州鉆柏科技有限公司生產(chǎn)的HPV DNA 市場(chǎng)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)14 種高危型別（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和68），含有任一種陽(yáng)性即視為陽(yáng)性。③HPV E6/E7 mRNA 檢查：采用河南中美合資科蒂亞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的E6/E7mRNA 試劑（支鏈DNA 信號(hào)擴(kuò)增法），使用科蒂亞公司自產(chǎn)的HS 冷光儀進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果為拷貝數(shù)，≥1copy/ml為陽(yáng)性。

1.2.2 陰道鏡檢查與宮頸活檢 使用電子陰道鏡系統(tǒng)，患者常規(guī)消毒鋪巾，充分暴露宮頸，生理鹽水清理宮頸表面多余的分泌物，將3%醋酸溶液涂抹宮頸表面，準(zhǔn)確記錄時(shí)間，觀察宮頸上皮組織變化，再將濃碘涂抹于宮頸上觀察著色情況，于所有可疑病變部位取樣活檢。對(duì)陰道鏡鏡下未見(jiàn)明顯異常者，則進(jìn)行常規(guī)四點(diǎn)活檢或者行宮頸管搔刮。所取標(biāo)本均由醫(yī)院專業(yè)的病理科醫(yī)師完成標(biāo)本的制片及診斷，若結(jié)果不一致則由兩位高年資醫(yī)師重新閱片，必要時(shí)行相應(yīng)免疫組織化學(xué)染色輔助診斷。

1.2.3 隨訪 根據(jù)2020 年美國(guó)陰道鏡和子宮頸病理學(xué)會(huì)發(fā)布的2019 版基于風(fēng)險(xiǎn)的子宮頸癌篩查異常及癌前病變管理共識(shí)指南，進(jìn)行分層處理：活檢HSIL+者立即行相對(duì)應(yīng)治療；活檢病理HSIL-者，1年后行TCT 及高危型HPV 檢測(cè)，上述檢測(cè)結(jié)果任何一項(xiàng)異常則行陰道鏡檢查及病理活檢。

1.3 統(tǒng)計(jì)字方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（百分率）[（%）]表示，組間比較采用檢驗(yàn)。對(duì)HPV E6/E7 mRNA 拷貝數(shù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布采用[（，）]表示。相關(guān)性分析采用Spearman。使用ROC 曲線下面積（area under the curve，AUC）對(duì)HPV E6/E7 mRNA 及HPV DNA 檢查的診斷效能，以及預(yù)測(cè)效能進(jìn)行描述與分析。＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸活檢病理情況

納入此次研究的198 例ASCUS 患者中，正常/慢性炎性反應(yīng)117 例（59.10%）、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）39 例（19.70%）、HSIL 40 例（20.20%）、宮頸癌2例（1.01%）。其中，HPV DNA 陽(yáng)性者144 例，HPV E6/E7 mRNA 陽(yáng)性者120 例。符合1 年后隨訪條件（病理活檢HSIL-）的156 例，其中失訪61 例，TCT 結(jié)果正常且HPV 陰性者69 例，TCT 異常或高危型HPV陽(yáng)性者26 例，行陰道鏡及活檢結(jié)果顯示：慢性炎性反應(yīng)17 例，LSIL6 例，HSIL3 例。

2.2 不同方法檢測(cè)宮頸病變及HSIL+的診斷效能

HPV DNA對(duì)正常/慢性炎性反應(yīng)及LSIL的陽(yáng)性檢出率優(yōu)于HPV E6/E7 mRNA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；HPV DNA 及HPV E6/E7 mRNA 對(duì)HSIL+的檢出率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 2 種檢測(cè)方法對(duì)各個(gè)級(jí)別宮頸病變檢出率比較

宮頸活檢病理HSIL+患者為42 例，HPV DNA 檢查的特異性低于HPV E6/E7 mRNA，使用McNemar檢驗(yàn)可見(jiàn)二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；HPV DNA檢查的敏感度與HPV E6/E7 mRNA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 2 種檢測(cè)方法對(duì)HSIL+的診斷效能比較

2.3 各級(jí)別宮頸病變患者的HPV E6/E7 mRNA 及病毒載量比較

各級(jí)別宮頸病變患者的HPV E6/E7 mRNA 的拷貝值經(jīng)Spearman 秩相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變級(jí)別的進(jìn)展，HPV E6/E7 mRNA 的陽(yáng)性率及拷貝值與之呈正相關(guān)（=1.0，0.791，＜0.05），且各病變級(jí)別差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

表3 各個(gè)級(jí)別宮頸病變患者的HPV E6/E7 mRNA 的病毒載量比較

2.4 ROC 曲線分析

2 種檢測(cè)方法對(duì)HSIL+的診斷效能行ROC 曲線分析，并計(jì)算AUC，發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA 拷貝值的AUC 值為0.941，分別大于HPV E6/E7 mRNA 定性的AUC 值0.735 及HPV DNA 的AUC 值0.613，診斷效能最高，具體詳見(jiàn)圖1、2。

圖1 病毒載量的ROC 曲線

圖2 HPV E6/E7 mRNA 及HPV DNA 定性ROC 曲線

2.5 隨訪1 年后疾病進(jìn)展情況

1 年后進(jìn)展為HSIL 患者3 位（2 位由LSIL 進(jìn)展，1 位由炎性反應(yīng)進(jìn)展），ROC 曲線分析初次HPV DNA 檢測(cè)及HPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)對(duì)1 年后病變進(jìn)展的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA 的AUC 值為0.783，大于HPV DNA 的AUC 值0.658，見(jiàn)圖3。

圖3 1 年后隨訪ROC 曲線

3 討論

ASCUS 的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)為細(xì)胞的異型性并不能滿足診斷上皮惡性病變，目前ASCUS 僅提示有高級(jí)別病變及癌變的危險(xiǎn)，因此需要一種對(duì)ASCUS 患者最好的分層處理方法。一種或多種高危型HPV 病毒持續(xù)性的感染可能會(huì)導(dǎo)致宮頸癌前病變的發(fā)展。高危型HPV 的檢測(cè)具有客觀、靈敏度高的特點(diǎn)。約70%～90%的HPV 陽(yáng)性女性，可通過(guò)自身免疫清除感染。但是HPV DNA 檢測(cè)并不能區(qū)分患者是否持續(xù)性感染。HPV E6/E7 基因主要參與病毒 DNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和凋亡等生理過(guò)程，參與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。病變的嚴(yán)重程度通常與每種HPV 類型中的E6 和E7 癌蛋白對(duì)靶蛋白的親和力有關(guān)：腫瘤抑制因子p53 和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白。E6 和E7 癌蛋白還通過(guò)與細(xì)胞蛋白結(jié)合影響宿主細(xì)胞活性，是宿主宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)生所必需的。此外，在HPV 病毒感染初期，HPV DNA 處于游離狀態(tài)，由于HPV E2蛋白的作用，抑制E6 和E7 基因轉(zhuǎn)錄；當(dāng)HPV DNA整合到宿主細(xì)胞上，E2 基因區(qū)被破壞，對(duì)E6 和E7基因的轉(zhuǎn)錄抑制消失，E6 和E7 癌蛋白大量表達(dá)。此外，Bruno 等的研究發(fā)現(xiàn)，HPV E6/E7 mRNA是疾病進(jìn)展的極好標(biāo)志物。因此，臨床上通過(guò)檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA 的水平間接判斷患者是否為持續(xù)性感染，可良好規(guī)避HPV DNA 檢測(cè)引起的一過(guò)性感染的問(wèn)題。本研究發(fā)現(xiàn)HPV DNA 對(duì)正常/慢性炎性反應(yīng)及LSIL 的檢出率優(yōu)于HPV E6/E7 mRNA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=6.178，4.04，＜0.05）；HPV DNA及HPV E6/E7 mRNA 對(duì)HSIL+的檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=1.053，＞0.05）。但是HPV E6/E7 mRNA 的特異性及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值優(yōu)于HPV DNA 檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。這與Ren 等的研究結(jié)果一致，認(rèn)為HPV E6/E7 mRNA 分流ASCUS 患者特異性高，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值好，因此可作為篩查出高級(jí)別病變的更優(yōu)方法，減少陰道鏡的轉(zhuǎn)診率，減少過(guò)度治療。

ASCUS 患者的HPV E6/E7 mRNA 的表達(dá)水平會(huì)隨宮頸病變的級(jí)別升高而升高，能有效預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，由于E6 和E7 基因整合到宿主細(xì)胞，HPV E6/E7 mRNA 作為癌基因的直接表達(dá)產(chǎn)物，其陽(yáng)性率會(huì)隨著宮頸病變級(jí)別的進(jìn)展而升高。對(duì)其HPV E6/E7 mRNA 的拷貝值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，發(fā)現(xiàn)其拷貝值會(huì)隨著宮頸病變級(jí)別的進(jìn)展而升高，對(duì)其陽(yáng)性率及拷貝值行Spearman 秩相關(guān)分析，HPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)的陽(yáng)性率及拷貝值與宮頸病變級(jí)別呈正相關(guān)（=1.0，0.791，＜0.05），且各病變級(jí)別差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。王玲玲等按照病理結(jié)果進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅱ組及宮頸癌組的病毒載量均高于CINⅠ組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且隨病變進(jìn)展病毒載量隨之升高，與本研究結(jié)果有一致性。

進(jìn)一步對(duì)ROC 曲線進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA 病毒載量的AUC 值為0.941，大于HPV E6/E7 mRNA 定性的AUC 值0.735 及HPV DNA 的AUC值0.613，進(jìn)而得出HPV E6/E7 mRNA 病毒載量及陽(yáng)性率均比HPV DNA 的診斷HSIL+的效能高。因此，對(duì)于ASCUS 患者行HPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)，若檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則考慮進(jìn)行陰道鏡檢查，可有效降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率。Ren 等、倪昌雪等和郭珍等研究對(duì)此也持有相同結(jié)果。但是本研究發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7mRNA 病毒載量的AUC 值最大，這與上述研究者的結(jié)果略有不同，考慮可能進(jìn)行HPV E6/E7 mRNA時(shí)，處于病毒復(fù)制活躍期，從而處于高拷貝狀態(tài)，因此得到得AUC 值最大，但是仍需大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論。

對(duì)符合隨訪條件且行隨訪的95 例患者1 年后行HPV 及TCT 檢測(cè)，上述檢查任意1 項(xiàng)陽(yáng)性者行陰道鏡檢查及活檢，并將活檢病理結(jié)果與初次HPV DNA及HPV E6/E7 mRNA 結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，遂行ROC 曲線進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA 的AUC 值為0.783，大于HPV DNA 的AUC 值0.658，因此發(fā)現(xiàn)HPV E6/ E7mRNA 還具有良好的預(yù)測(cè)高級(jí)別病變的效能。這與潘學(xué)景等研究結(jié)果高度一致。Pruski等的研究顯示，隨著年齡的增長(zhǎng)，HPV E6/E7 mRNA 的敏感度和特異性更高，但是本研究未行年齡分層統(tǒng)計(jì)分析，郭珍等認(rèn)為，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在≥45 歲年齡組和＜45 歲年齡組中分流的敏感度均為100%，在≥45 歲年齡組中分流的特異性為79.0%（95%：73.7～83.5），比＜45 歲年齡組的特異性（68.3%，95%：53.0～80.4）高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。因此是否考慮對(duì)年齡≥45 歲且HPV E6/E7 mRNA 結(jié)果為陽(yáng)性的患者進(jìn)行干預(yù)治療，延緩宮頸病變的進(jìn)一步發(fā)展，仍有待商榷。

Brun等和Giorgi等的研究發(fā)現(xiàn)，HPV E6/E7 mRNA 陰性時(shí)，對(duì)HSIL 的消退具有極好的預(yù)測(cè)價(jià)值，而B(niǎo)run 等在對(duì)HPV 陽(yáng)性女性研究中發(fā)現(xiàn)，HPV E6/E7 mRNA 預(yù)測(cè)CINⅡ的消退率達(dá)到約60%。因此，對(duì)于ASCUS 患者HPV E6/E7 mRNA 結(jié)果為陰性的女性，無(wú)需進(jìn)行進(jìn)一步的陰道鏡檢查，做好隨訪工作，能夠減少高級(jí)別病變的漏診率，避免醫(yī)療資源的浪費(fèi)。

綜上所述，對(duì)于ASCUS患者，可以根據(jù)其HPV E6/E7 mRNA 的結(jié)果進(jìn)行可能發(fā)生的病變的初步評(píng)估，并根據(jù)其評(píng)估結(jié)果考慮是否行陰道鏡檢查，最后可根據(jù)患者的HPV E6/E7 mRNA 的結(jié)果有效預(yù)測(cè)發(fā)展為高級(jí)別病變的風(fēng)險(xiǎn)，建議HPV E6/E7 mRNA 可作為一種新的方法進(jìn)行ASCUS 患者的分流，減少過(guò)度診療及漏診、誤診率，控制患者的疾病進(jìn)展，指導(dǎo)臨床工作。