牛曉穎，牟曉晴，孫杰,，張春江，趙志磊，田特

(1.河北大學(xué) 質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督學(xué)院，河北 保定 071002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室，北京 100193)

驢肉營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特，兼具多種醫(yī)療保健價值，深受廣大消費者喜愛[1].由于中國肉驢集約化養(yǎng)殖規(guī)模不大，同時市場需求較大，導(dǎo)致生驢存欄量逐年下降[2].驢肉稀缺，從而使驢肉價格較高，生鮮驢肉目前市場價在120元/kg左右，比豬、牛、羊肉等普遍高100%以上.為牟取較高的利潤，驢肉市場存在摻假問題，損害消費者權(quán)益，也給食品安全帶來隱患.目前，對肉類進(jìn)行鑒別的方法主要包括基于形態(tài)學(xué)、代謝物、核酸及蛋白質(zhì)的檢測方法[3-6].使用的技術(shù)有液質(zhì)聯(lián)用/氣質(zhì)聯(lián)用[7-9]、聚合酶鏈反應(yīng)[10-14]、DNA條形碼[15-16]、近紅外光譜[17-21]等，與其他畜禽肉相比，驢肉營養(yǎng)價值高，具有高蛋白、高人體必需氨基酸、高不飽和脂肪酸及低脂肪、低膽固醇、低熱量的特點[22-23]，但檢測驢肉和其他肉類的營養(yǎng)成分含量，并據(jù)此進(jìn)行分類的研究報道較少.在已應(yīng)用的鑒別方法和技術(shù)中，近紅外光譜法與其他方法相比，具有快速、無損的特點，但作為間接方法，無法對鑒別結(jié)果進(jìn)行機(jī)理解釋，對肉類樣品的營養(yǎng)成分進(jìn)行檢測并進(jìn)行區(qū)別分析也可以作為近紅外光譜法的解釋和補(bǔ)充.本文使用索氏抽提法和凱氏定氮法分別檢測了樣品的肌間脂肪和蛋白質(zhì)含量，采用氣相色譜法檢測了樣品的多種脂肪酸，并使用陽離子交換色譜分離、茚三酮柱后衍生法對樣品的多種氨基酸含量進(jìn)行了檢測.對驢肉和其他肉類樣品的脂肪、蛋白質(zhì)、12種脂肪酸、17種氨基酸及總氨基酸含量進(jìn)行了單因素方差分析，對不同差異水平的指標(biāo)組合分別進(jìn)行了主成分分析，篩選了對驢肉和其他肉類樣品分類的有效營養(yǎng)成分組合.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

40個生鮮驢肉樣品(取自不同個體樣本的不同部位，購自保定市永茂驢肉)，生鮮豬肉、牛肉、羊肉樣品各8個，購自保定時代超市；實驗前將樣品上的脂肪和筋膜盡量去除干凈，使用絞肉機(jī)攪碎成肉糜備用，脂肪和蛋白質(zhì)測定所使用的無水乙醚、無水硫酸鉀、硫酸銅和濃硫酸等均為國產(chǎn)分析純，脂肪酸及氨基酸測定所使用的標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純.

1.2 儀器與設(shè)備

KJELTEC 2300全自動凱氏定氮儀(FOSS，丹麥)；SER148型脂肪測定儀(VECP公司，意大利)；GC7890氣相色譜儀(Agilent，美國)；L-8900 型全自動氨基酸分析儀(Hitachi，日本)；絞肉機(jī)(名健MGC-090，中國).

1.3 方法

1.3.1 脂肪和蛋白質(zhì)的檢測

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.6——2016《食品中脂肪的測定》，稱取充分混合均勻的肉糜樣品2～5 g，使用索氏抽提法檢測了樣品的肌間脂肪含量；按照GB 5009.5——2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》，稱取充分混合均勻的肉糜樣品0.2～2 g，使用凱氏定氮法檢測了樣品的蛋白質(zhì)含量.取3次平行樣的平均值為樣品含量數(shù)據(jù).

1.3.2 脂肪酸的檢測

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5413.27——2010《嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測定》中的方法制備樣品，稱取0.5 g左右的肉樣于干燥螺口玻璃管中，加5 mL甲苯，再加6 mL乙酰氯甲醇，充氮1 min排出管內(nèi)空氣，旋緊螺旋蓋，振蕩混合后于80 ℃水浴中放置2 h，期間每隔20 min取出振蕩一次，水浴后取出冷卻至室溫.將反應(yīng)后的樣液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，混勻，5 000 r/min離心5 min，取上清液，用甲苯稀釋10倍后，混勻，過0.2 μm膜，待測.

氣相色譜儀工作條件為色譜柱：固定液100%二氰丙基聚硅氧烷(100 m×0.25 mm，0.20 μm)；載氣：氮氣；載氣流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；分流比：30∶1；檢測器溫度：280 ℃；柱溫箱溫度：初始溫度140 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升溫至240 ℃，保持15 min；進(jìn)樣量：1.0 μL.

1.3.3 氨基酸的檢測

使用酸水解的方法進(jìn)行樣品前處理，精密稱取肉樣(含50 mg蛋白)于水解管中，加入10 mL 6 mol/L的鹽酸，充氮1 min排出管內(nèi)空氣，旋緊螺旋蓋.將管放于110 ℃烘箱中水解24 h.取出樣品冷卻至室溫后，混勻過濾，用去離子水充分清洗水解管，將全部樣品轉(zhuǎn)移并定容至50 mL容量瓶內(nèi).混勻后，吸取1 mL進(jìn)行氮吹至吹干,后用0.02 mol/L鹽酸復(fù)溶到5 mL，吸取1 mL水解液過0.2 μm濾膜到進(jìn)樣瓶中，參考文獻(xiàn)[24-25]使用全自動氨基酸分析儀檢測樣品的17種氨基酸含量.

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 16.0(SPSS公司，美國)對驢肉和其他肉類樣品的營養(yǎng)成分指標(biāo)進(jìn)行了單因素方差分析(one-way analysis of variance，one-way ANOVA)，使用MATLAB 7.0(MathWorks公司，美國)進(jìn)行了主成分分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同肉類樣品營養(yǎng)成分含量差異分析

本節(jié)對驢肉、牛肉、羊肉和豬肉樣品中的脂肪、蛋白質(zhì)、脂肪酸和氨基酸指標(biāo)分別進(jìn)行了單因素方差分析.根據(jù)方差分析規(guī)定，若F>F0.01，認(rèn)為不同肉類樣品的該指標(biāo)差異極顯著，因此對分類的影響高度顯著，作標(biāo)記**；若F0.05

2.1.1 脂肪和蛋白質(zhì)差異分析

表1為不同種類生鮮肉類樣品脂肪和蛋白質(zhì)指標(biāo)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差、F值及F臨界值，從表1中可以看出，不同樣品的脂肪和蛋白質(zhì)含量均在水平1%上具有顯著差異，脂肪和蛋白質(zhì)2個指標(biāo)對不同種類生鮮肉樣品分類的影響高度顯著.

表1 不同肉類樣品脂肪和蛋白質(zhì)含量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差、F值及F0.01臨界值Tab.1 Mean±standard deviation,F value and F0.01 of differences in crude fat and protein for different fresh meat samples

為進(jìn)一步分析驢肉和其他肉類樣品在脂肪和蛋白質(zhì)指標(biāo)上的差異，本節(jié)還分別對驢肉/牛肉，驢肉/羊肉及驢肉/豬肉樣品進(jìn)行了單因素方差分析，結(jié)果見表2.從表2中可以發(fā)現(xiàn)，驢肉/羊肉的脂肪含量差異極顯著，和其他肉類樣品的脂肪含量沒有顯著差異；驢肉/牛肉、驢肉/羊肉的蛋白質(zhì)含量差異極顯著，其中又以驢肉/羊肉的蛋白質(zhì)含量差異最為顯著，驢肉/豬肉的蛋白質(zhì)含量沒有顯著差異.總體來看，驢肉樣品的脂肪含量在4種肉類樣品中處于較低水平，而蛋白質(zhì)含量則處于較高水平.驢肉/豬肉的脂肪和蛋白質(zhì)含量均無顯著差異，這可能與本研究中豬肉樣品的取樣為通脊肉有關(guān)，豬通脊肉為豬脊椎骨內(nèi)側(cè)的條狀嫩肉，為純瘦肉，脂肪含量低、蛋白質(zhì)含量高.

所以AC2(BD1·BD2)=AB2·BC2-AB2·BC·(BD1+BD2)+AB2(BD1·BD2)，

表2 驢肉和其他肉類樣品脂肪和蛋白質(zhì)的F值及F臨界值Tab.2 F value and F critical values of differences in crude fat and protein for fresh meat samples of donkey and other species respectively

2.1.2 脂肪酸差異分析

本研究檢測了24種脂肪酸在樣品中的含量，其中肉豆蔻酸(C14:0)、十五碳酸(C15:0)、棕櫚酸(C16:0)、棕櫚油酸(C16:1n7)、硬脂酸(C18:0)、二十四碳一烯酸(C24:1n9)、亞油酸(C18:2n6c)、十七碳酸(C17:0)、反式油酸(C18:1n9t；C18:1n11t)和油酸(C18:1n9c)10種脂肪酸在樣品中普遍存在，因此用于本部分的差異分析.樣品的不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸含量通過對24個檢測指標(biāo)中相應(yīng)類型的脂肪酸含量求和得到.

從表3中可以看出，不同樣品的肉豆蔻酸、十五碳酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞油酸、油酸及不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸含量均在水平1%上具有極顯著差異，說明這些指標(biāo)對不同種類生鮮肉樣品分類的影響高度顯著.

對具有差異的脂肪酸指標(biāo)進(jìn)行了多重差異分析，如表4.驢肉/牛肉含量具有極顯著差異的指標(biāo)包括肉豆蔻酸、十五碳酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、亞油酸及不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸；驢肉/羊肉含量具有極顯著差異的指標(biāo)有肉豆蔻酸、十五碳酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞油酸、油酸、不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸；驢肉/豬肉含量具有極顯著差異的僅有亞油酸，具有顯著差異的有肉豆蔻酸、棕櫚油酸、硬脂酸、二十四碳一烯酸和不飽和脂肪酸，說明亞油酸在驢肉/豬肉樣品的分類中起到了關(guān)鍵作用.脂肪酸是脂肪的基本組成成分，2.1.1節(jié)中對脂肪含量差異的分析發(fā)現(xiàn)，驢肉/豬肉樣品的脂肪含量不具有顯著差異，這和表4中驢肉/豬肉樣品的多個脂肪酸含量差異不顯著的情況一致.

表4 驢肉和其他肉類樣品脂肪酸的F值及F臨界值Tab.4 F values and F critical values of differences in fatty acids for fresh meat samples of donkey and other species respectively

2.1.3 氨基酸差異分析

本研究檢測了17種氨基酸在不同肉類樣品中的含量.總氨基酸含量通過對游離氨基酸含量求和獲得.從表5中可以看出，蘇氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、組氨酸和脯氨酸7種游離氨基酸對分類的影響顯著；門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、精氨酸和總氨基酸7種氨基酸對分類有一定的影響；其他氨基酸對分類沒有顯著影響.總體來說，不同肉類氨基酸的含量差異不大，這可能與其含量普遍偏低有關(guān).

表5 不同肉類樣品氨基酸含量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差、F值及F臨界值Tab.5 Mean±standard deviation,F value and F critical values of differences in amino acids for different fresh meat samples

對不同肉類樣品具有差異的氨基酸指標(biāo)含量進(jìn)行了多重差異分析，如表6.從表6中可以看出，驢肉/牛肉的蘇氨酸、絲氨酸、亮氨酸和賴氨酸含量具有顯著差異，甘氨酸含量不具有顯著差異，其他氨基酸含量均具有一定差異；驢肉/羊肉的組氨酸含量具有顯著差異，門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸和總氨基酸含量具有一定差異，其他氨基酸不具有顯著差異；驢肉/豬肉的脯氨酸含量具有顯著差異，甘氨酸含量具有一定差異，其他氨基酸不具有顯著差異.

表6 驢肉和其他肉類樣品氨基酸的F值及F臨界值Tab.6 F values and F critical values of differences in amino acids for fresh meat samples of donkey and other species respectively

2.2 不同差異水平指標(biāo)的主成分分析

為進(jìn)一步驗證不同差異水平指標(biāo)對不同肉類樣品分類的影響，本節(jié)分別對具有極顯著差異的11個指標(biāo)(脂肪、蛋白質(zhì)、肉豆蔻酸、十五碳酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞油酸、油酸及不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸)、具有顯著差異的9個指標(biāo)(二十四碳一烯酸、反式油酸、蘇氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、組氨酸和脯氨酸)、具有一定差異的7個指標(biāo)(門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、精氨酸和總氨基酸)的濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行了主成分分析.

2.2.1 全部具有差異指標(biāo)的主成分分析

對27個具有差異的指標(biāo)數(shù)據(jù)提取了主成分，前3主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)到82.18%，解釋的差異超過80%，可用于代替原變量進(jìn)行聚類趨勢的分析.圖1為前3主成分圖，從圖1中可以看出，牛肉、羊肉可以和驢肉清晰地區(qū)分開，而豬肉和驢肉樣品混雜在一起，無法分開.根據(jù)3.1節(jié)的分析可知，驢肉和豬肉樣品的各項指標(biāo)差異較小，從而導(dǎo)致2種樣品分類時發(fā)生了混疊，以下從不同差異水平指標(biāo)的角度觀察分類效果的改善情況.

2.2.2 極顯著差異指標(biāo)的主成分分析

對具有極顯著差異的11個指標(biāo)提取了主成分，前3主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到79.49%，接近80%，可進(jìn)行聚類分析.圖2為差異極顯著指標(biāo)的前3主成分得分圖，從圖2中可以看出，4種不同的肉類樣品呈現(xiàn)了明顯的聚類趨勢，驢肉和牛肉、羊肉樣品可以清楚地區(qū)分開，但驢肉和豬肉樣品有重疊現(xiàn)象.

圖1 不同肉類樣品具有差異指標(biāo)數(shù)據(jù)前3主成分得分Fig.1 Different meat sample scores plot for PC1,PC2 and PC3 of chemical composition data with significant difference

圖2 不同肉類樣品差異極顯著指標(biāo)數(shù)據(jù)前3主成分得分Fig.2 Scores plot for PC1,PC2 and PC3 of chemical composition data with difference significant at 0.01 level

為進(jìn)一步觀察驢肉和其他肉類的區(qū)分情況，分別繪制了驢肉/牛肉、驢肉/羊肉的前2主成分得分圖，及驢肉/豬肉的第2、3主成分得分圖，見圖3.從圖3a和3b中可以發(fā)現(xiàn)，驢肉/牛肉、驢肉/羊肉的差異極顯著指標(biāo)前2 主成分有明顯差異，可以進(jìn)行清楚的區(qū)分.圖3c驢肉/豬肉的第2和第3主成分二維圖中，2類樣品的區(qū)分比圖2的三維圖更加清晰，聚類趨勢更加明顯，沒有出現(xiàn)三維圖中的重疊現(xiàn)象，說明第2和第3比第1主成分得分包含有更多兩類數(shù)據(jù)的差異特征.

a.驢肉/牛肉;b.驢肉/羊肉;c.驢肉/豬肉.圖3 不同肉類樣品差異極顯著指標(biāo)數(shù)據(jù)主成分得分二維圖Fig.3 2-dimension scores plot of chemical composition data with difference significant at 0.01 level

2.2.3 顯著差異指標(biāo)的主成分分析

圖4 不同肉類樣品差異顯著指標(biāo)數(shù)據(jù)前3主成分得分Fig.4 Scores plot for PC1,PC2 and PC3 of chemical composition data with difference significant at 0.05 level

對具有顯著差異的9個指標(biāo)提取了主成分，前3主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到98.98%.圖4為顯著差異指標(biāo)的前3主成分得分圖，從圖4中可以發(fā)現(xiàn)，4種樣品有聚類趨勢，但與極顯著差異指標(biāo)主成分圖2相比，其他肉類樣品的重疊現(xiàn)象更加嚴(yán)重，驢肉樣品也有一部分和牛肉、羊肉樣品重疊在一起.為進(jìn)一步觀察本部分指標(biāo)對驢肉和不同肉類樣品分類的影響，使用所提取的主成分得分進(jìn)行了驢肉和其他肉類樣品的二維分析，見圖5.與三維圖相比，從圖5中可以更加清楚地觀察驢肉和其他肉類的重疊情況，可以發(fā)現(xiàn)，驢肉樣品中有一小部分樣品與牛肉、羊肉和豬肉樣品均有所重疊，說明這些樣品的二十四碳一烯酸、反式油酸、蘇氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、組氨酸和脯氨酸這9個指標(biāo)的濃度數(shù)據(jù)特征較為相似.總體來說，差異顯著指標(biāo)的分類效果明顯不如差異極顯著指標(biāo).

本文還提取了有一定差異的門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、精氨酸和總氨基酸7個指標(biāo)的主成分，繪制前3主成分三維圖后發(fā)現(xiàn)不同肉類樣品完全混雜在一起，沒有明顯的聚類趨勢.說明在水平1%上具有顯著差異的指標(biāo)不適合用于不同肉類樣品的鑒別，其差異不足以將不同肉類樣品區(qū)別開來.

a.驢肉和牛肉;b.驢肉和羊肉;c.驢肉和豬肉.圖5 不同肉類樣品差異顯著指標(biāo)數(shù)據(jù)主成分得分二維圖Fig.5 2-dimension scores plot of PC1 and PC2 with difference significant at 0.05 level

3 結(jié)論

本文使用單因素方差分析對脂肪、蛋白質(zhì)、12種脂肪酸、18種氨基酸共32個指標(biāo)在不同肉類樣品中的含量差異進(jìn)行了分析，差異極顯著的指標(biāo)有脂肪、蛋白質(zhì)、9種脂肪酸(肉豆蔻酸、十五碳酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞油酸、油酸及不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸)；差異顯著的有2種脂肪酸(二十四碳一烯酸、反式油酸)、7種氨基酸(蘇氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、組氨酸和脯氨酸)；有一定差異的有門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、精氨酸和總氨基酸7種氨基酸；沒有顯著差異的有十七碳酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸.

對驢肉、豬肉、牛肉和羊肉樣品營養(yǎng)成分中不同差異水平的指標(biāo)進(jìn)行了主成分分析發(fā)現(xiàn)：具有極顯著差異的指標(biāo)提取主成分后對驢肉和其他肉類的區(qū)分效果最好，可以達(dá)到完全分開.極顯著差異指標(biāo)包括脂肪、蛋白質(zhì)、肉豆蔻酸、十五碳酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞油酸、油酸及不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸，是驢肉和其他肉類分類的關(guān)鍵成分，其中脂肪、脂肪酸類指標(biāo)占絕大部分.根據(jù)文獻(xiàn)[1,26]可知，脂肪及其脂肪酸組成結(jié)構(gòu)是形成肉類獨特風(fēng)味的重要原因和來源，因此，使用脂肪、脂肪酸類指標(biāo)在樣品中的含量數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒別分析，即使用不同肉類樣品獨特風(fēng)味化合物的組成結(jié)構(gòu)特征對其進(jìn)行鑒別.而不同肉類樣品的風(fēng)味特征有所區(qū)別，因此能夠區(qū)分開來.