曹云祥， 劉 健△， 陶艷紅， 黃傳兵， 黃 旦， 徐昌萍

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)， 合肥 230031)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是多因素導(dǎo)致可累及多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為對稱性、侵蝕性多關(guān)節(jié)炎[1]，女性發(fā)病率較高，約為男性的3倍，多發(fā)生于30～50歲的中青年，全球患病率約1%，中國為0.32% ～0.36%[2，3]。隨著疾病的發(fā)展，RA患者最終可出現(xiàn)關(guān)節(jié)功能障礙，對生活質(zhì)量產(chǎn)生較大的影響。除關(guān)節(jié)表現(xiàn)外，該病還可累及神經(jīng)、消化、血液、內(nèi)分泌等多個系統(tǒng)，大多數(shù)患者的死亡原因為關(guān)節(jié)外病變[4，5]。目前RA的發(fā)病機制仍不明確，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1等促炎因子被認(rèn)為參與RA的發(fā)生發(fā)展。目前，慢作用抗風(fēng)濕藥、生物制劑等一線治療藥物的臨床使用極大地提高了RA治療的成功率[6]，但治療后會發(fā)生不同程度的不良反應(yīng)，中醫(yī)藥治療本病有較好的互補效應(yīng)。

RA屬于中醫(yī)學(xué)“痹證” “尪痹”范疇，中醫(yī)藥辨證論治聯(lián)合西藥治療RA不僅能增加療效，減少致殘率，提高生活質(zhì)量，還能減少西藥用量，減輕西藥的毒副作用。本研究旨在通過觀察中藥復(fù)方新風(fēng)膠囊(xinfeng capsule，XFC)對RA患者巨噬細(xì)胞極化及核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路的影響，探究其作用機制。本研究通過安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批號20190627)。

1 資料

1.1 一般資料

選擇2020年5月至2020年10月安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕病科門診與病房就診病例60例RA患者，按照隨機數(shù)字表法分為對照組和研究組。其中，治療組男性6例，女性24例，平均年齡(55. 57±6.89)歲，平均病程(8.26±3.65) 年。對照組男性4例，女性26例，平均年齡(51.73±8.76)歲，平均病程(8.31±3.49) 年。2組患者年齡與病程比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2010 年美國風(fēng)濕病學(xué)會和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟提出的《最新RA分類標(biāo)準(zhǔn)和評分系統(tǒng)》，總分6分以上可診斷RA[7]。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2019年中華中醫(yī)藥學(xué)會發(fā)布的《RA病證結(jié)合診療指南》[8]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合RA分類診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡20～70歲；知情同意并配合藥物治療的患者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

不符合納入標(biāo)準(zhǔn)；合并其他系統(tǒng)如腫瘤、感染等疾病者；關(guān)節(jié)畸形嚴(yán)重者。

1.5 脫落標(biāo)準(zhǔn)

依從性差，服用藥物劑量少于規(guī)定量的80%或超出120%，療效及安全性判斷受干擾者；自行退出者；病情加重或者有其他疾病需要治療者；發(fā)生嚴(yán)重副作用者。

1.6 剔除標(biāo)準(zhǔn)

不遵守規(guī)定服藥，隨訪資料欠缺者；不遵守治療方案而影響療效或安全性者；曾經(jīng)有或者現(xiàn)仍濫用藥物者。

1.7 主要試劑及儀器

TNF-a、IL-1β、IL-4、IL-10 Elisa試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司，貨號JYM0110Hu、JYM0083Hu、JYM0142Hu、JYM0155Hu)；淋巴細(xì)胞分離液(加拿大StemCell公司，貨號17952)；熒光定量 PCR檢測試劑盒(蘇州近岸蛋白質(zhì)科技有限公司，貨號E096-01B)；RIPA細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號P0013B)；核因子κB P65(nuclear factor kappa-B P65, NF-κB p65)抗體、核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制蛋白α(nuclear transcription factor kappa B repressor protein alpha, IκBα)抗體(美國CST公司，貨號8242 T、3033 T)；β-actin抗體、山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號TA-09、ZB-2305、ZB-2301)。

2 方法

2.1 治療方法

對照組患者給予甲氨蝶呤口服每周1次，每次4片；治療組在對照組基礎(chǔ)上加XFC口服治療，每日3次，每次 3 粒。甲氨蝶呤由上海上藥信誼藥廠有限公司提供(國藥準(zhǔn)字H21020644，2.5 mg)。XFC組成：黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤，每粒含生藥0.4 g，由安徽省中醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)(批號皖藥制 Z20050062)，2 組患者均連續(xù)服藥4周。

2.2 生活質(zhì)量評價

RA患者生活質(zhì)量采用中醫(yī)證候積分量表與生活質(zhì)量評價量表(short form-36, SF-36)進(jìn)行評價[9，10]。由受過培訓(xùn)的醫(yī)務(wù)人員對研究對象進(jìn)行量表填寫指導(dǎo)，所有量表在發(fā)放后1 h收回，確保全部回收并檢查有無漏填之處。SF-36評分量表具體條目包括一般健康(general health, GH)、生理功能(physical functioning, PF)、生理職能(role-physical, RP)、情感職能(role-remotional, RE)、社會功能(social functioning, SF)、軀體疼痛(body pain, BP)、精力(vitality, VT)、精神健康(mental health, MH)。

2.3 Elisa檢測血清炎癥因子表達(dá)

取各組患者治療前后空腹靜脈血離心取上清，參考試劑盒操作說明書檢測各組血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10的表達(dá)。

2.4 RA相關(guān)指標(biāo)RF、CCP-AB、ESR、CRP檢測

取各組患者治療前后空腹靜脈血，Elisa法檢測血清類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-cyclic citrullinated peptide, CCP-AB)；魏氏法檢測血漿紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR),免疫透射比濁法檢測血清C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)，以上指標(biāo)均由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗中心檢測。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD80、CD86、CD163、CD206表達(dá)

取各組患者治療前后空腹靜脈血，免疫磁珠法分選巨噬細(xì)胞，配制含10%人AB血清和10ng/mL人GM-CSF的IMDM培養(yǎng)液，培養(yǎng)基重懸CD14細(xì)胞，誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞。調(diào)整巨噬細(xì)胞濃度為0.5×106/L～1×106/L個細(xì)胞，處理后上機檢測。

2.6 Western blot檢測巨噬細(xì)胞中NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)

加入RIPA細(xì)胞裂解液，提取治療前后各組巨噬細(xì)胞中總蛋白，加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h洗滌，加一抗IκBα(1∶500)、NF-κB p65(1∶1000)4 ℃過夜，加1∶10000二抗孵育2 h，顯影后拍照、保存圖像并分析數(shù)據(jù)。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 脫落情況

無患者脫落，全部完成研究。

3.2 新風(fēng)膠囊對RA患者生活質(zhì)量的影響

表1示，與治療前比較，2組患者治療后中醫(yī)證候積分均明顯降低(P<0.01)，SF-36各條目評分均明顯升高(P<0.05，P<0.01)。與對照組比較，治療組患者SF-36量表RE、SF、BP、VT條目評分明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

表1 各組類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中醫(yī)證候積分與SF-36評分比較(分，

3.3 新風(fēng)膠囊對RA患者血清炎癥因子的影響

表2示，與治療前比較，2組患者治療后TNF-α、IL-1β表達(dá)水平均明顯降低，IL-4、IL-10表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)；與對照組治療后比較，治療組治療后TNF-α表達(dá)水平明顯降低，IL-10表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。

表2 各組類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清炎癥因子表達(dá)比較

3.4 新風(fēng)膠囊對RA患者血RF、CCP-AB、ESR、CRP的影響

表3示，與治療前比較，2組患者治療后RF、CCP-AB、ESR、CRP表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)；與對照組治療后比較，治療組治療后RF、ESR、CRP表達(dá)水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)。

表3 各組類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血RF、CCP-AB、ESR、CRP水平比較

3.5 新風(fēng)膠囊對RA患者巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物的影響

圖1示，2組患者治療前巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，2組患者治療后與各自治療前比較，巨噬細(xì)胞CD80、CD86 表達(dá)明顯降低，CD163、CD206表達(dá)明顯升高(P<0.05)；治療組治療后較對照組CD80、CD86 表達(dá)顯著降低，CD163、CD206 表達(dá)明顯升高(P<0.05)。

注：A.各組流式圖； B.細(xì)胞標(biāo)記率；與本組治療前比較：*P<0.05；與對照組治療后比較：#P<0.05；FL1-A—PE/cy7anti-humancd80，F(xiàn)L2-A—APC anti-humancd86，F(xiàn)L3-A—FITC anti-humancd206，F(xiàn)L4-A—PE anti-humancd163圖1 各組類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者治療前后巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物表達(dá)比較

3.6 新風(fēng)膠囊對RA患者NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)的影響

圖2示，與治療前比較，2組患者治療后NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯降低，IκBα明顯升高(P<0.05)；與對照組治療后比較，治療組患者NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯降低，IκBα明顯升高(P<0.05)。

注：A.蛋白條帶圖；B.蛋白相對表達(dá)量；與本組治療前比較：*P<0.05；與對照組治療后比較：#P<0.05圖2 各組類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者NF-κB p65、IκBα 蛋白表達(dá)比較

3.7 不良反應(yīng)

治療過程中，觀察組出現(xiàn)1例胃脘部不適患者，對照組出現(xiàn) 1 例白細(xì)胞降低患者，處理后均恢復(fù)正常。

4 討論

RA是一種慢性、進(jìn)展性和難治性的自身免疫性疾病，以慢性滑膜炎、血管翳形成、軟骨和骨的破壞為特征，最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形[11]。RA患者關(guān)節(jié)持續(xù)疼痛、免疫炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)功能障礙癥狀嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。甲氨蝶呤為治療RA的一線藥物，然而部分患者因多種原因不能耐受，因此尋求適合RA患者的中西醫(yī)結(jié)合治療方案有較大的臨床意義。

劉健[12]認(rèn)為，脾胃虧虛、氣血不足、痰瘀痹阻為RA基本病機，治療應(yīng)以健脾化濕通絡(luò)為法。XFC又稱復(fù)方芪薏膠囊，為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑(專利號ZL201310011369.8)，全方由黃芪、薏苡仁、蜈蚣、雷公藤組成，應(yīng)用于臨床30年療效顯著。前期進(jìn)行的一項大樣本、多中心平行組設(shè)計、雙盲的隨機對照試驗結(jié)果顯示，XFC能夠有效改善RA患者關(guān)節(jié)癥狀，緩解病情，總體療效優(yōu)于來氟米特[9]。XFC具有很好的抗炎、抑制免疫炎癥反應(yīng)的作用，能降低RA患者ESR、hs-CRP、RF、CCP等實驗室指標(biāo)，還能通過抑制NF-κB通路激活，降低血清中促炎因子的水平來減輕免疫炎癥反應(yīng)，改善RA癥狀[13，14]。

多種免疫細(xì)胞與炎性介質(zhì)在RA發(fā)病中發(fā)揮重要作用[15]。單核巨噬細(xì)胞作為機體防御系統(tǒng)重要的免疫細(xì)胞，在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)過程中具有多方面的作用。不同因素可誘導(dǎo)不同亞型的巨噬細(xì)胞，表現(xiàn)為具有促炎作用的M1型和抗炎作用M2型[16-18]。巨噬細(xì)胞大量向M1極化，炎癥因子分泌失衡，誘發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”。大量的促炎因子聚集會抑制組織的修復(fù)和血管重塑，并促進(jìn)免疫反應(yīng)；同時M2細(xì)胞減少，抗炎因子表達(dá)下降，進(jìn)一步加劇免疫炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞大量遷移到靶器官、組織并被激活，引起滑膜炎癥及晨僵，最終導(dǎo)致炎性骨破壞。M1型巨噬細(xì)胞可分泌多種促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1等)，表達(dá)CD80、CD86等分子，促進(jìn)炎癥的發(fā)展。M2型巨噬細(xì)胞分泌抗炎因子(IL-4、IL-10、TGF-β等)，表達(dá)CD206和CD163等分子，發(fā)揮抗炎作用。因此，抑制巨噬細(xì)胞M1型炎性極化，驅(qū)動M1型轉(zhuǎn)為M2型，促進(jìn)恢復(fù)M1/M2型巨噬細(xì)胞動態(tài)平衡，有利于調(diào)節(jié)RA免疫炎癥反應(yīng)。本研究表明，XFC可能是通過降低RA患者CD80、CD86、TNF-α、IL-1β、ESR、CRP表達(dá)，升高CD163、CD206、IL-4、IL-10表達(dá)，調(diào)整M1/M2型巨噬細(xì)胞極化失衡，從而降低中醫(yī)證候積分，改善生活質(zhì)量。

NF-κB通路是重要的促炎傳導(dǎo)途徑，被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞極化的重要調(diào)控因子，該通路激活能促進(jìn)M1/M2極化，使細(xì)胞因子表達(dá)失衡，引發(fā)炎癥反應(yīng)[19，20]。IκBα是NF-κB信號通路的重要成員，主要抑制NF-κB的激活及轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)[21]。本研究表明，XFC能顯著降低NF-κB p65、升高IκBα蛋白表達(dá)，通過調(diào)控IκBα抑制NF-κB信號通路激活，繼而平衡M1/M2極化，減輕RA的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮治療RA的作用。

綜上，本研究初步表明，XFC能夠通過抑制NF-κB通路過度活化，調(diào)控M1/M2極化，上調(diào)抗炎因子,下調(diào)促炎因子表達(dá)，改善 RA患者的生活質(zhì)量。