劉莉莉， 閻國強(qiáng)， 梁 震， 李 蘭， 段芳芳， 萬乃君

(北京積水潭醫(yī)院， 北京 100035)

肥胖已成為突出的公共衛(wèi)生問題，尤其是兒童肥胖的患病率日趨上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國7歲以上學(xué)齡兒童肥胖率由0.5%增至7.3%[1]。肥胖不僅能夠?qū)е赂哐獕?、高膽固醇等代謝性問題[2]，還會影響兒童的生長發(fā)育[3]。臨床研究表明，針刺能夠降低肥胖患者的體質(zhì)量和體質(zhì)量指數(shù)[4]，改善血糖血脂[5]?；A(chǔ)研究也證實(shí)，針刺能夠改善成年雄性肥胖大鼠的糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗[6]。但既往研究中，針刺對兒童肥胖代謝紊亂的作用研究較少，機(jī)制研究也多以雄性大鼠為肥胖模型[7]。為進(jìn)一步觀察針刺對生長期雌性大鼠的干預(yù)作用，本研究擬通過建立高脂飲食誘導(dǎo)的雌性幼年大鼠肥胖模型，研究電針對雌性生長期肥胖大鼠的糖脂代謝相關(guān)指標(biāo)及腎周脂肪組織形態(tài)的影響。本研究通過北京積水潭醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)(批號積倫動審字第201909-01)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級21 d齡SD雌性大鼠36只，體質(zhì)量50～60 g，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK(京)2019-0010。飼養(yǎng)于北京積水潭醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室，室溫(25±2)℃，濕度(55±5)%，24 h恒溫恒濕，每天保持12 h晝夜循環(huán)，自由進(jìn)食飲水，3只/籠盒飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

胰島素(insulin, INS)試劑盒(優(yōu)爾生生物公司，L200731037)；瘦素(leptin, LEP)試劑盒(優(yōu)爾生生物公司，L200717805)。

SDZ-Ⅱ型電針治療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；一次性無菌針灸針(北京中研太和醫(yī)療器械有限公司，0.22 mm×13 mm)；臺式高速冷凍離心機(jī)(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，D3024R)；全自動生化分析儀(深圳雷杜生命科技，Chemray 240/800)；酶標(biāo)檢測儀(美國BioTeK，Epoch)；切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，RM 2016)；正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康，NIKON ECLIPSE CI)。

1.3 動物造模及分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法選取6只大鼠作為對照組，給予普通飼料喂養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；其余大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，誘導(dǎo)肥胖模型，6周后將符合肥胖標(biāo)準(zhǔn)的大鼠隨機(jī)分為模型組和電針組各6只，模型組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束期間無任何治療，電針組在給予高脂飼料喂養(yǎng)的同時，給予電針治療2周。動物造模采用SPF級高脂飼料誘導(dǎo)肥胖模型，高脂飼料能量配方含有脂肪45%，碳水化合物35%，蛋白質(zhì)20%(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)，給予高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)6周。以高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的體質(zhì)量高于普通飼料喂養(yǎng)大鼠體質(zhì)量平均值的20%及以上作為肥胖成模標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 電針干預(yù)

清醒固定電針組大鼠，使用0.22 mm×13 mm無菌針灸針，針刺雙側(cè)“三陰交”“豐隆”“足三里”[8，9]，連接電針儀設(shè)置電針頻率為2 Hz,強(qiáng)度0.5～1.2 mA，每次30 min，每日1次，連續(xù)干預(yù)14 d。為排除電針組大鼠操作的應(yīng)激因素影響，對照組和模型組大鼠每天給予相同時間的固定操作，但不進(jìn)行電針干預(yù)。

1.5 標(biāo)本采集

大鼠禁食12 h后，用3%戊巴比妥鈉溶液，按0.19 mL/100 g的劑量腹腔注射麻醉。心臟取血5 mL，離心后取上清液，-80 ℃凍存。取大鼠腎周脂肪組織，4%多聚甲醛固定。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 體質(zhì)量與腹圍測量 每周稱取并記錄大鼠體質(zhì)量和腹圍。大鼠腹圍即大鼠腹部劍突與后肢間垂直距離中點(diǎn)的周長。

1.6.2 血清生化檢測 采用全自動生化儀檢測血清總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、血糖(blood glucose, GLU)水平。

1.6.3 ELISA檢測 對血清樣本按不同的試劑盒說明書進(jìn)行ELISA檢測，測定血清INS、LEP的含量。

1.6.4 HE染色法觀察腎周脂肪組織 大鼠麻醉后取腎周圍同一部位脂肪，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚4 μm，然后進(jìn)行HE染色，高倍光學(xué)顯微鏡下觀察全視野脂肪細(xì)胞形態(tài)、脂肪細(xì)胞體積和數(shù)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量與腹圍比較

圖1示，造模后與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量和腹圍明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療后與對照組比較，模型組體質(zhì)量、腹圍均高于對照組(P<0.05)；與模型組比較，電針組大鼠體質(zhì)量、腹圍明顯降低(P<0.05)。

注：與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05圖1 各組大鼠體質(zhì)量與腹圍比較

2.2 各組大鼠血清脂代謝比較

圖2示，與對照組比較，模型組大鼠血清TC、TG明顯升高，血清HDL明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，電針組大鼠血清TC、TG明顯下降(P<0.05)，HDL有升高趨勢但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，LDL-C三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；總膽固醇(total cholesterol, TC)，甘油三酯(triglyceride, TG)，高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)圖2 各組大鼠血清脂代謝比較

2.3 各組大鼠瘦素、血糖和胰島素比較

圖3示，與對照組比較，模型組大鼠血清LEP、GLU、INS明顯升高(均P<0.05)；與模型組比較，電針組大鼠血清LEP、GLU、INS明顯下降(P<0.05)。

注：與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；血糖(blood glucose, GLU)，胰島素(insulin, INS)，瘦素(leptin, LEP)圖3 各組大鼠血清瘦素、血糖與胰島素比較

2.4 各組大鼠腎周脂肪形態(tài)比較

圖4示，HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠的脂肪細(xì)胞排列緊湊、數(shù)量多、體積小且形態(tài)正常；與對照組比較，模型組脂肪細(xì)胞體積大、形態(tài)飽滿，細(xì)胞內(nèi)可見空泡狀大脂滴及被脂滴推擠至細(xì)胞一側(cè)的扁平細(xì)胞核；與模型組比較，電針組大鼠腎周脂肪細(xì)胞體積明顯減小，細(xì)胞內(nèi)空泡脂滴減小，胞質(zhì)皺縮，胞體塌陷。

注：藍(lán)色箭頭所指為空泡大脂滴推擠至一側(cè)的細(xì)胞核，紅色箭頭所指為皺縮的脂肪細(xì)胞圖4 各組大鼠腎周脂肪組織形態(tài)比較(HE染色×200)

3 討論

肥胖不僅與營養(yǎng)成分和飲食習(xí)慣相關(guān)，還受社會、環(huán)境及遺傳等因素的影響[10]。研究表明，兒童期肥胖會影響內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)，導(dǎo)致罹患心血管疾病、2型糖尿病、代謝性紊亂風(fēng)險(xiǎn)增加，還會致青春期發(fā)育提前、成年后罹患生殖道腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加[11]。因此，兒童期肥胖的治療干預(yù)對改善代謝紊亂及預(yù)防并發(fā)癥具有重要意義。中醫(yī)認(rèn)為，兒童期和青少年期肥胖與飲食不節(jié)、勞逸過度及先天稟賦有關(guān)，其病機(jī)在于脾胃失調(diào)不能運(yùn)化水谷精微，從而出現(xiàn)痰濁濕滯、胃熱濕阻、肝郁化火、陰虛內(nèi)熱等證[12]。本研究采用針刺干預(yù)，主要以平衡陰陽、健運(yùn)脾胃、通調(diào)水道為法，選穴以太陰、陽明經(jīng)穴位為主，取豐隆、足三里、三陰交。豐隆為足陽明胃經(jīng)絡(luò)穴，別走太陰，溝通脾胃兩經(jīng)，清降痰濁，為治痰要穴；足三里為胃經(jīng)合穴，健脾化濕益氣；三陰交為足三陰經(jīng)交會穴，健脾益腎。此三穴為調(diào)節(jié)內(nèi)分泌代謝及生殖疾病的常用選穴，共奏清熱利濕、化痰消脂、健脾益胃之效[13]。

脂代謝異常是引起心腦血管病變的重要危險(xiǎn)因素，TC和TG水平升高是導(dǎo)致冠心病發(fā)病和動脈粥樣硬化的主要原因[14]，因此調(diào)節(jié)和改善肥胖大鼠的脂代謝紊亂十分必要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清TC、TG明顯升高，說明高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖能夠?qū)е律L期大鼠的血脂代謝紊亂，經(jīng)電針干預(yù)后，大鼠血清TC、TG明顯下降，說明電針可以改善生長期雌性肥胖大鼠的脂代謝水平，對降低TC、TG具有良性調(diào)節(jié)作用。

INS參與糖代謝及脂肪、蛋白質(zhì)代謝，是一種重要的生長調(diào)節(jié)激素；LEP是一種肽類激素, 由脂肪組織分泌，對肥胖有重要調(diào)控作用，能夠增加能量消耗、抑制食欲和脂肪合成[15]。INS和LEP都是調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝的外周因子，還能作為獨(dú)立因子在糖代謝和脂肪代謝中發(fā)揮作用。研究表明，高濃度LEP會破壞INS信號通路，使INS敏感性降低，導(dǎo)致GLU水平升高，出現(xiàn)INS抵抗[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肥胖能夠誘導(dǎo)生長期雌性肥胖大鼠的GLU、INS、LEP上升，說明肥胖可以導(dǎo)致糖代謝紊亂，并進(jìn)一步出現(xiàn)INS抵抗，INS分泌過多刺激脂肪組織分泌LEP，導(dǎo)致高LEP血癥。這一研究結(jié)果與既往臨床研究中肥胖兒童血清GLU、INS、LEP水平高于健康兒童的研究結(jié)果一致[17]。針刺干預(yù)后，電針組與模型組比較，血清INS、GLU、LEP明顯降低，說明針刺可以改善高脂飲食誘導(dǎo)的雌性生長期大鼠的INS敏感性，糾正糖代謝紊亂和高瘦素血癥。針刺對高瘦素血癥的良性調(diào)節(jié)，能夠增加INS的敏感性，充分發(fā)揮對血糖的調(diào)控功能，從而達(dá)到針刺對糖脂能量相關(guān)代謝的良性平衡調(diào)節(jié)。

本研究脂肪組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，模型組肥胖大鼠的腎周脂肪細(xì)胞胞體飽滿，細(xì)胞內(nèi)可見空泡狀大脂滴，體積明顯增大，提示高脂飲食誘導(dǎo)腎周脂肪組織形態(tài)異常改變；針刺干預(yù)后，電針組大鼠腎周脂肪細(xì)胞內(nèi)空泡脂滴減小，體積明顯減小，胞體塌陷，胞質(zhì)皺縮，說明針刺能夠明顯改善脂肪細(xì)胞的組織形態(tài)。

綜上所述，電針能夠改善生長期雌性肥胖大鼠的糖脂代謝紊亂，降低INS和LEP水平，改善腎周脂肪的組織形態(tài)，本研究為臨床治療肥胖兒童相關(guān)代謝性紊亂提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。