李 蕾 張俊濤 曹淑萍

1.山東省東營市東營區(qū)人民醫(yī)院病理科，山東東營 257000；2.山東省東營市東營區(qū)人民醫(yī)院婦科，山東東營 257000

宮頸癌作為女性第四大常見的惡性腫瘤，嚴重影響女性健康。在我國每年宮頸癌新發(fā)病例13.15 萬，宮頸癌已成為我國中青年女性的第二大高發(fā)惡性腫瘤，發(fā)病人群趨于年輕化，每年大約有5 萬人死于該病。P300/CBP 相關(guān)因子（P300/CBP-related factor，PCAF）是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶GNAT 家族中的重要一員，與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并且在腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移和腫瘤中血管的生成發(fā)揮重要作用。P53 被認為是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤的發(fā)生相關(guān)性最高的抑癌基因。本研究通過檢測宮頸癌組織內(nèi)PCAF 和P53 的表達水平，探討PCAF、P53 與宮頸癌病例特點之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月至2020年6月東營市東營區(qū)人民醫(yī)院病理科保存并經(jīng)病理證實的宮頸癌組織79例（鱗狀細胞癌57 例，腺癌22 例）作為實驗組，選取同期20 例正常宮頸組織作為對照組。實驗組患者年齡38～70 歲，平均（46.2±5.23）歲；≥50 歲37例，<50歲42 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期54 例，Ⅲ～Ⅳ期25例；病理分級：G1～G2 期45 例，G3 期34 例。對照組年齡35～69 歲，平均（45.4±6.72）歲，兩組的年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準（2020-008），患者及家屬均知情并簽署知情同意書。納入標準：①患者臨床資料完整；②均為首發(fā)病例；③所有患者術(shù)前均無化療、放療以及免疫治療史。

1.2 主要試劑和實驗方法

PCAF 單克隆抗體購自美國Santa Cruz 生物公司，批號：sc-13124。P53 單克隆抗體購自邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號：MX008。采用免疫組化SP 法染色：組織石蠟塊5 μm 切片，二甲苯進行常規(guī)脫蠟，然后依次放入濃度由低到高的乙醇中脫水，蒸餾水沖洗3 次，每次3 min，待充分水化后，用PBS 洗3 次，每次5 min，加入3%過氧化氫滅活內(nèi)源性的過氧化物酶10 min，再用PBS 洗3 次，每次5 min，20%山羊血清室溫下封閉30 min，滴加一抗，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃下1～2 h 或4℃過夜，PBS 洗3 次，每次5 min，然后加入二抗，37℃孵育30 min，PBS 洗3 次，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果判定

陽性細胞標準為細胞內(nèi)出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒，PCAF 定位在細胞質(zhì)和細胞核，P53 定位在細胞核。根據(jù)細胞質(zhì)、細胞核染色強度以及著色陽性細胞所占百分率進行綜合評價計分，隨機選擇每張切片中10 個高倍鏡視野（400×），每個視野計數(shù)100 個細胞，切片的著色陽性細胞百分率為所有視野中陽性細胞的平均百分率。染色強度評分標準（A）：0 分為無色，1 分為黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色。著色陽性細胞所占百分率評分標準（B），陽性細胞<5%為0 分，陽性細胞5%～25%為1 分，陽性細胞26%～50%為2 分，陽性細胞51%～75%為3 分，陽性細胞>75%為4 分。最終以A+B 所得分數(shù)作為評判標準：≤2 分為陰性，≥3 分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用率表示，兩組間比較采用χ檢驗；采用Spearman 等級相關(guān)分析對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織中P53 蛋白和PCAF 的表達及與臨床病理特征的相關(guān)性

實驗組的PCAF 陽性表達率為41.8%，低于對照組的80.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。實驗組的PCAF 陽性表達率隨宮頸癌臨床分期及病理分級的增高而逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。不同年齡和組織學(xué)類型患者的PCAF 陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。實驗組的P53 陽性表達率（78.5%）高于對照組（0%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。實驗組的P53 陽性表達率隨宮頸癌臨床分期及病理分級的增高而逐漸增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。不同年齡和組織學(xué)類型患者的P53 陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

表1 宮頸癌組織中P53 蛋白和PCAF 的表達及與臨床病理特征的相關(guān)性

2.2 P53 和PCAF 在宮頸癌中表達的相關(guān)性

P53 和PCAF 在宮頸癌中的表達呈中度負相關(guān)（r=-0.493，P<0.05）（表2）。

表2 P53 和PCAF 在宮頸癌中表達的相關(guān)性（例）

3 討論

PCAF 是真核細胞內(nèi)一種重要的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，可以乙?；诵慕M蛋白H3 和H4，組蛋白被PCAF 乙?；笈cDNA 結(jié)合能力降低，核小體結(jié)構(gòu)松弛，各種轉(zhuǎn)錄因子更易與DNA 結(jié)合，從而調(diào)控相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平。PCAF 還是一種轉(zhuǎn)錄輔激活子，當結(jié)合在啟動子或增強子附近位點時，促進下游基因轉(zhuǎn)錄。除此之外，PCAF 還可以使一些非組蛋白發(fā)生乙?；?，從而參與DNA 損傷修復(fù)、細胞分化、增殖以及凋亡等細胞過程。另有研究發(fā)現(xiàn)PCAF 不僅具有乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，也具有E3 連接酶的功能，可以促進有關(guān)蛋白泛素化修飾，進而參與細胞代謝，調(diào)節(jié)細胞周期。

PCAF 被認為是一種抑癌候選基因，既往研究發(fā)現(xiàn)其可以在一定程度上抑制多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，PCAF 在多種腫瘤細胞中表達下調(diào)，并且與不良預(yù)后緊密相關(guān)。PCAF 在多數(shù)原發(fā)性肝細胞肝癌中呈現(xiàn)低表達，并發(fā)現(xiàn)PCAF 的下調(diào)與門靜脈侵犯明顯相關(guān)。PCAF 可以誘導(dǎo)肝癌細胞的凋亡和自噬、抑制肝癌轉(zhuǎn)移。PCAF 對骨肉瘤細胞有正向調(diào)節(jié)作用，PCAF通過靶向自噬相關(guān)基因ATG5 和ATG7 調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞組蛋白H3S28 磷酸化，進而促進瘤細胞的自噬。有研究發(fā)現(xiàn)，PCAF 的陽性表達率在食管癌組織中明顯低于正常食管組織。PCAF 的低表達是胃癌發(fā)生的重要因素，PCAF 低表達患者的生存期明顯低于PCAF 高表達患者，與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。關(guān)于CAF 在宮頸癌中的研究較少，本研究通過免疫組化研究宮頸癌與正常宮頸組織中PCAF 的表達，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中的PCAF 表達明顯低于正常宮頸組織，并且隨著宮頸癌臨床分期和組織學(xué)分級的增高，其表達率顯著下降，提示PCAF 有可能成為宮頸癌及其預(yù)測預(yù)后的一種重要的生物學(xué)分子標志物。同時隨著腫瘤個性化治療的發(fā)展，PCAF 亦被人認為是腫瘤治療的潛在靶點。PCAF 通過促進鋅指轉(zhuǎn)錄因子Gli1 的泛素化來抑制Hh 信號對DNA 損傷的應(yīng)答，提示PCAF可能成為Hh 依賴性腫瘤的治療靶點。PCAF 的高表達可以增強結(jié)直腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的藥物敏感性。

P53 基因是一種腫瘤抑癌基因，有突變型和野生型之分。野生型P53 是一種重要的抑癌基因，作為一個“分子警察”在細胞周期中起著重要的作用，調(diào)控細胞周期中的增殖細胞，通過控制G0 或G1 期細胞進入S 期，進而抑制細胞的增殖。在人類大約一半的腫瘤中，P53 基因發(fā)生突變。突變后的P53 基因失去抑制細胞增殖的功能，導(dǎo)致腫瘤侵襲力增加，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，成為一種癌基因。野生型的P53 的表達極不穩(wěn)定，因此無法用免疫組化的方法檢測出，突變型的P53 容易堆積在細胞中，半衰期延長，可以用免疫組化檢測出。既往研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸上皮內(nèi)瘤變時P53的陽性表達率隨著瘤變程度的增加而逐漸增高，P53和Ki-67、p63 聯(lián)合檢測被認為是可靠地區(qū)分宮頸上皮內(nèi)瘤變的生物標志物。在對401 例宮頸癌組織進行的研究發(fā)現(xiàn)中，高P53 蛋白水平與侵襲性表型和生存標記顯著相關(guān)，認為高P53 水平可獨立預(yù)測宮頸癌的低生存率。更有學(xué)者分析證實P53 的過度表達提示白種人宮頸癌的預(yù)后不良。本研究結(jié)果顯示，P53的陽性表達率隨著宮頸癌的臨床分期和組織學(xué)分級的增高而逐漸增高，進一步證實了P53 可以作為評定宮頸癌預(yù)后的一種重要生物標志物。作為一種重要的抑癌基因，將野生型P53 轉(zhuǎn)染瘤細胞而用于抑制腫瘤或者增強化療藥物的敏感性一直是人們研究的熱點，外源野生型P53 導(dǎo)入宮頸癌HeLa 細胞后，可與羥喜樹堿發(fā)揮協(xié)同作用，有效抑制宮頸癌HeLa 細胞增殖促其凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究結(jié)果還顯示，在宮頸癌中突變的P53 和PCAF 兩種蛋白的表達緊密相關(guān)，隨著突變型P53 蛋白的增加，PCAF 的表達逐漸降低。PCAF 是抑癌基因P53 的共激活子，它通過調(diào)節(jié)P53 的活性及其蛋白的穩(wěn)定性來使細胞周期停滯和細胞凋亡，進而影響細胞分化、凋亡與腫瘤形成。PCAF 蛋白作為一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶可以直接對P53 進行乙酰化修飾，通過PCAF-P53-p21 軸來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖。PCAF蛋白亦可以通過其泛素化酶活性間接作用于P53，去乙?；D(zhuǎn)移酶SIRT7 與PCAF 相互作用后促進了PCAF 與MDM2 的結(jié)合，進而促進MDM2 的泛素化降解，使得腫瘤細胞中的P53 更加穩(wěn)定，有利于腫瘤細胞的周期阻滯，抑制腫瘤細胞的增殖。PCAF 還可以通過泛素化修飾調(diào)控Hdm2 進而影響細胞內(nèi)P53 蛋白表達水平。敲除PCAF 的結(jié)腸癌HCT116 細胞，P53 的乙?；矫黠@降低，P53 依賴性P21 的轉(zhuǎn)錄明顯降低，從而導(dǎo)致腫瘤細胞周期蛋白D1 和磷酸化增加。同時野生型的P53 可以誘導(dǎo)PCAF 的表達。總之，本研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中P53 的高表達與PCAF表達的降低密切相關(guān)，提示這兩種蛋白可能在宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同作用。

綜上所述，宮頸癌的發(fā)生是多個基因共同作用的復(fù)雜過程。本研究顯示PCAF 在宮頸癌中表達水平低于正常宮頸組織，并且隨著宮頸癌的臨床分期和組織學(xué)分級的增高而逐漸降低，提示PCAF 可能作為宮頸癌及其預(yù)測預(yù)后的分子標志物。本研究還證實PCAF蛋白和P53 蛋白在宮頸癌中的表達緊密相關(guān)，并且與宮頸癌惡性臨床病理特征相關(guān)，提示二者在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著協(xié)同作用，二者聯(lián)合運用有望成為宮頸癌潛在預(yù)后不良的分子標志物，同時給宮頸癌的精準個性化治療提供新思路和新方法。