陳銀楠 劉 勇 陳悅悅 李 巍▲

1.揚州大學醫(yī)學院轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究院，江蘇揚州 225009；2.大連理工大學生命科學與藥學學院，遼寧大連 124221

伊立替康是治療實體瘤的常用化療藥，在體內(nèi)發(fā)揮活性需先經(jīng)由羧酸酯酶水解為具有藥理活性的代謝產(chǎn)物SN-38 繼而發(fā)揮出抗腫瘤活性。同時，SN-38 可由UDP-葡萄糖苷酸轉(zhuǎn)移酶1A1（UDP-glucuronosyltransferase 1A1，UGT1A1） 催化為SN-38G 而失去活性。同服UGT1A1 抑制藥物與伊立替康是藥物相互作用引發(fā)不良反應的常見原因。

紫草在《中華人民共和國藥典》記載具有清熱涼血、活血解毒等功效，在中醫(yī)典籍《本草綱目》中也記載了紫草有治療炎癥的功效。紫草素是從紫草中提取的具有生物活性的化合物。此外，近年來藥理學研究還發(fā)現(xiàn)紫草素具有抗腫瘤、抗炎等作用。腫瘤患者有服用含紫草素的中藥或紫草茶等保健品的可能，將來研究也可能將紫草素與伊立替康聯(lián)合使用以提高抗腫瘤藥效。因此，有必要評價紫草素與伊立替康同服是否會因抑制UGT1A1 進而引發(fā)草藥-藥物相互作用。

此外，UGT1A1 基因多態(tài)性是導致其活性的個體差異的重要原因。UGT1A1*6 突變基因型在亞洲人群中有較高的出現(xiàn)頻率。在接受伊立替康治療時，攜帶UGT1A1*6 基因型的患者SN-38 血藥濃度相對UGT1A1*1 患者更高，更易發(fā)生嚴重毒性（如中性粒細胞減少癥）。然而，紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6 催化SN-38 的葡萄糖醛酸化反應的抑制作用差異尚無報道。

本研究使用重組人UGT1A1*1 和UGT1A1*6 進行體外研究，探討紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6催化SN-38 代謝的抑制作用，為避免臨床藥物之間的相互作用提供理論參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑和儀器

傘形酮（批號：BCCC1923）、二甲基亞砜（批號：BCBW5664）和甲酸（批號：H2014333）均購自阿拉丁公司（中國上海）；六水氯化鎂（批號：20150202）購自國藥集團化學試劑有限公司（中國上海）。Tris-HCL緩沖液（pH=7.4）和紫草素（批號：1210E021）均購自北京索萊寶科技有限公司； 尿苷葡萄糖醛酸三鈉 （5′-diphosphoglucuronic acid trisodium salt，UDPGA）（批號：C13203250） 購自上海麥克林生化科技有限公司；乙腈（批號：SHBN0815）購自德國Merck 公司；重組人UGT1A1*1 和UGT1A1*6 利用本課題組昆蟲表達系統(tǒng)表達和制備。

超高效液相色譜QTRAP 6500 三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX），配有離子源是電噴霧離子化源（ESI）和Analyst 1.4.2 數(shù)據(jù)處理軟件。AUY120 電子天平來自日本島津公司； 可調(diào)速渦旋混合器來自Scientific Industries 公司；恒溫混勻儀（Thermo Mixer C）來自德國艾本德公司；小型臺式冷凍離心機（Centrifuge 5424 R）來自德國艾本德公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制 用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制40 mmol/L 紫草素儲備液，于-20°C 保存；用DMSO 將上述儲備液稀釋為紫草素濃度分別為0.2、1、2、5、10、50 和100 μmol/L 的工作液待用。UDP GA 用Tris-HCl 緩沖液（50 mmol/L，pH=7.4）稀釋成濃度為50 mmol/L 的儲備液，于-80°C 保存待用。氯化鎂工作液（100 mmol/L）用超純水配制，4°C 保存待用，保存時間不超過4 h。傘形酮（內(nèi)標）用乙腈配制成2 μmol/L 的工作液，放置于4°C 待用。SN-38 用DMSO配制成濃度為500 μmol/L 和600 μmol/L 的工作液備用，-20℃冰箱長期避光保存。

1.2.2 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS） 分析條件 使用本課題組已建立的UPLC-MS/MS 方法定量檢測SN-38葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物SN-38G 的生成速率。色譜和質(zhì)譜方法簡單描述如下：待分析樣品進樣2 μl 后，使用流動相A（水，含0.1%甲酸）和流動相B（乙腈，含0.1%甲酸）于35℃下采用BEH Ccolumn（50 mm×2.1 mm，1.7 μm Waters 公司，Milford，MA） 色譜柱梯度洗脫分離。洗脫梯度條件為0～2 min，5%的流動相B；2.0～2.4 min，5%→50%的流動相B；2.4～3.0 min，50%的流動相B；3～4 min，50%→5%的流動相B；4～5 min，5%的流動相B。基于多反應監(jiān)測（multiple-reaction monitoring，MRM）模式下，ESI 電離串聯(lián)質(zhì)譜法進行待測樣品的檢測。ESI 源參數(shù)：噴霧電壓為5 500 V；碰撞氣為medium；離子源霧化器為35 psi；加熱輔助器為30 psi；氣簾氣為30 psi；停留時間為100 msc；離子傳輸毛細管溫度為500℃；傘形酮去簇電壓為42 V，碰撞能為31 V）；SN-38G（去簇電壓為20 V，碰撞能為45 V）。SN-38G 的母離子和子離子質(zhì)荷比（m/z）分別為569.2和393.2。傘形酮（內(nèi)標）的母離子和子離子m/z 分別為163.1 和107.1。

1.2.3 紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6 催化SN-38葡萄糖醛酸化反應的抑制作用 SN-38 分別與濃度為0、1、10 和100 μmol/L 的紫草素在氯化鎂（10 mmol/L）、Tris-HCl（50 mmol/L，pH 7.4）和UGT1A1*1 或UGT1A1*6（5.2 nmol/L） 存在的條件下于37℃預孵育5 min 后，加入10 μL UDPGA（2.5 mmol/L 起始反應）。反應體系總體積為200 μL，其中有機溶劑（DMSO）最終濃度為1% （v/v）。SN-38 的終濃度接近其被UGT1A1 代謝的K值，UGT1A1*1 組為2.5 μmol/L，UGT1A1*6 組為3 μmol/L。37℃反應30 min 后，加入等體積4℃預冷的乙腈（含2 μmol/L 內(nèi)標傘形酮）終止反應。待測樣品在4°C 下以20 500×g 離心30 min，取上清。UPLCMS/MS 檢測SN-38G 濃度。所有實驗均重復3 次。

1.2.4 紫草素對UGT1A1＊1 和UGT1A1＊6 催化SN-38代謝抑制的半抑制濃度 （half-maximal inhibitory concentration，IC） 濃度梯度為0、0.2、1、2、5、10、50 和100 μmol/L 的紫草素分別與SN-38 在氯化鎂（10 mmol/L）、Tris-HCl（50 mmol/L，pH 7.4）和UGT1A1*1 或UGT1A1*6（5.2 nmol/L）存在的條件下，于37℃預孵育5 min 后，加入UDPGA（2.5 mmol/L）起始反應。反應體系總體積為200 μl，其中有機溶劑（DMSO）最終濃度為1%（v/v）。SN-38 的終濃度接近其被UGT1A1 代謝的K值，UGT1A1*1 組為2.5 μmol/L，UGT1A1*6 組為3 μmol/L。37℃反應30 min 后加入200 μl 含內(nèi)標（傘形酮濃度為2 μmol/L）的乙腈終止反應。樣品在4℃條件下用20 500 r/min離心30 min 去除蛋白沉淀，UPLC-MS/MS 檢測上清中SN-38G 的含量。使用GraphPad prism 7.0 對剩余酶活性與藥物濃度之間的關(guān)系繪圖，獲得相應的IC。所有實驗均重復3 次。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6 催化SN-38葡萄糖醛酸化反應的抑制作用

紫草素可抑制UGT1A1 催化的SN-38 葡萄糖醛酸化反應。當其濃度為1、10 和100 μmol/L 時，UGT1A1*1催化SN-38 葡萄糖醛酸化的反應速率均低于對照組（未加紫草素）的反應速率，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖1A）。而且隨著紫草素濃度的升高，UGT1A1*1催化的SN-38 葡萄糖醛酸化反應速率降低，1、10和100 μmol/L 紫草素組的反應速率分別為對照組的80.044%、29.318%和4.906%，各組差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖1A）。相似的，對于UGT1A1*6 催化的SN-38 葡萄糖醛酸化反應，紫草素濃度在1 至100 μmol/L 范圍也可顯著抑制SN-38G 的生成。紫草素在1、10 和100 μmol/L 濃度下SN-38 代謝產(chǎn)物（SN-38G）的生成速率均低于對照組（未加紫草素）的生成速率，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖1B）。同時，隨著紫草素濃度的升高，UGT1A1*6 催化的SN-38G 的生成速率降低，1、10 和100 μmol/L 紫草素組中的反應速率分別為對照組的86.462%、43.145%和5.248%，且各組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖1B）。紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6 催化SN-38 葡萄糖醛酸化的抑制作用均隨紫草素濃度的升高而增強。

圖1 不同濃度的紫草素對UGT1A1＊1 和UGT1A1＊6 催化的SN-38G 生成速率的影響

2.2 紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6 催化SN-38代謝抑制的IC50

在進一步定量分析紫草素對UGT1A1 催化SN-38 葡萄糖醛酸化的研究中發(fā)現(xiàn)，在0.2～100 μmol/L內(nèi)，紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6 均表現(xiàn)出了隨著紫草素濃度升高而增強的抑制作用，IC值分別為4.357 μmol/L 和7.353 μmol/L（圖2）。紫草素對UGT1A1*1和UGT1A1*6 催化的SN-38 葡萄糖醛酸化均具有抑制作用。

圖2 紫草素對UGT1A1＊1（A）和UGT1A1＊6（B）催化的SN-38 葡萄糖醛酸化反應活性的抑制作用

3 討論

目前草藥或其主要活性成分和西藥間的相互作用被廣泛關(guān)注，已有報道證實了部分草藥可能通過抑制藥物代謝酶而引發(fā)草藥-藥物相互作用。UGT1A1是人體內(nèi)代謝伊立替康活性代謝產(chǎn)物SN-38 的關(guān)鍵酶，多種影響因素例如其基因單核苷酸多態(tài)性或同服藥物相互作用等皆可影響UGT1A1 酶的活性，進而導致體內(nèi)過度蓄積伊立替康活性代謝產(chǎn)物SN-38，引發(fā)中性粒細胞減少、腹瀉等不良反應。值得注意的是，在人和大鼠肝微粒體的體外研究中發(fā)現(xiàn)，紫草素也可抑制UGT1A1 催化的β-雌二醇-3-葡萄糖醛酸化。該結(jié)果表明紫草素是UGT1A1 的抑制劑，提示了伊立替康與含紫草素的制劑聯(lián)合使用時，紫草素可能會通過抑制UGT1A1 活性，進而增加SN-38 血藥濃度并導致伊立替康不良反應的發(fā)生。但目前尚無定量研究評價紫草素是否抑制SN-38 的葡萄糖醛酸化，是否存在引發(fā)草藥-藥物相互作用的風險。

本研究發(fā)現(xiàn)紫草素對野生型UGT1A1（即UGT1A1*1）催化SN-38 的葡萄糖醛酸化存在抑制作用，且該抑制作用隨紫草素濃度的升高而增強，IC值為4.357 μmol/L。中藥對藥物代謝酶的抑制程度可以分為強抑制、中等抑制和弱抑制，當IC值小于10 μmol/L時為強抑制，IC值在10～50 μmol/L 之間為中等抑制，IC值大于50 μmol/L 時為弱抑制。根據(jù)本研究結(jié)果，紫草素對野生型UGT1A1 存在強抑制作用，當含紫草素的制劑與伊立替康同服時，需注意引發(fā)草藥-藥物相互作用的風險。

UGT1A1*6 這種UGT1A1 編碼區(qū)突變的突變體在亞洲人群中出現(xiàn)頻率較高（為16%～40%），該突變會導致SN-38 的代謝清除降低。研究發(fā)現(xiàn)紫草素對UGT1A1*6 也存在較強的抑制作用，IC值為7.353 μmol/L，盡管該值高于對UGT1A1*1 抑制的IC，對其抑制作用弱于UGT1A1*1，但仍處在強抑制作用范圍內(nèi)。此外，臨床研究發(fā)現(xiàn)，基因型為UGT1A1*6純合突變的個體SN-38 存在約二倍的血漿濃度-時間曲線下面積（area under the plasma concentrationtime curve，AUC）升高。因此，基因型為UGT1A1*6的患者服用紫草素制劑會進一步增加SN-38 的血藥濃度，造成因SN-38 在體內(nèi)的過多積累，存在進一步加重伊立替康不良反應的風險。因此，聯(lián)合使用紫草素制劑與伊立替康時更需注意患者的基因型，以免引發(fā)不良發(fā)應。

綜上所述，紫草素與伊立替康共同服用時，可能通過抑制UGT1A1 催化的SN-38 的代謝，從而增加SN-38 的血藥濃度，存在引發(fā)草藥-藥物相互作用的風險。紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6 的抑制均屬于強抑制作用，但對前者的抑制作用更強。同時考慮到UGT1A1*6 純合基因型患者本身SN-38 代謝清除降低，對此類基因型聯(lián)用紫草素制劑和伊立替康更需注意草藥-藥物相互的潛在風險。本研究結(jié)果為科學指導紫草素制劑和伊立替康合理聯(lián)用提供理論基礎(chǔ)，避免因UGT1A1 抑制而導致的藥物不良反應的發(fā)生，具有重要參考的價值。