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        紫草素對UGT1A1*1和UGT1A1*6催化SN-38葡萄糖醛酸化的抑制作用研究

        2022-10-20 07:12:40陳銀楠陳悅悅
        中國當代醫(yī)藥 2022年27期

        陳銀楠 劉 勇 陳悅悅 李 巍▲

        1.揚州大學醫(yī)學院轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究院,江蘇揚州 225009;2.大連理工大學生命科學與藥學學院,遼寧大連 124221

        伊立替康是治療實體瘤的常用化療藥,在體內(nèi)發(fā)揮活性需先經(jīng)由羧酸酯酶水解為具有藥理活性的代謝產(chǎn)物SN-38 繼而發(fā)揮出抗腫瘤活性。同時,SN-38 可由UDP-葡萄糖苷酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UDP-glucuronosyltransferase 1A1,UGT1A1) 催化為SN-38G 而失去活性。同服UGT1A1 抑制藥物與伊立替康是藥物相互作用引發(fā)不良反應的常見原因。

        紫草在《中華人民共和國藥典》記載具有清熱涼血、活血解毒等功效,在中醫(yī)典籍《本草綱目》中也記載了紫草有治療炎癥的功效。紫草素是從紫草中提取的具有生物活性的化合物。此外,近年來藥理學研究還發(fā)現(xiàn)紫草素具有抗腫瘤、抗炎等作用。腫瘤患者有服用含紫草素的中藥或紫草茶等保健品的可能,將來研究也可能將紫草素與伊立替康聯(lián)合使用以提高抗腫瘤藥效。因此,有必要評價紫草素與伊立替康同服是否會因抑制UGT1A1 進而引發(fā)草藥-藥物相互作用。

        此外,UGT1A1 基因多態(tài)性是導致其活性的個體差異的重要原因。UGT1A1*6 突變基因型在亞洲人群中有較高的出現(xiàn)頻率。在接受伊立替康治療時,攜帶UGT1A1*6 基因型的患者SN-38 血藥濃度相對UGT1A1*1 患者更高,更易發(fā)生嚴重毒性(如中性粒細胞減少癥)。然而,紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6 催化SN-38 的葡萄糖醛酸化反應的抑制作用差異尚無報道。

        本研究使用重組人UGT1A1*1 和UGT1A1*6 進行體外研究,探討紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6催化SN-38 代謝的抑制作用,為避免臨床藥物之間的相互作用提供理論參考依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 實驗試劑和儀器

        傘形酮(批號:BCCC1923)、二甲基亞砜(批號:BCBW5664)和甲酸(批號:H2014333)均購自阿拉丁公司(中國上海);六水氯化鎂(批號:20150202)購自國藥集團化學試劑有限公司(中國上海)。Tris-HCL緩沖液(pH=7.4)和紫草素(批號:1210E021)均購自北京索萊寶科技有限公司; 尿苷葡萄糖醛酸三鈉 (5′-diphosphoglucuronic acid trisodium salt,UDPGA)(批號:C13203250) 購自上海麥克林生化科技有限公司;乙腈(批號:SHBN0815)購自德國Merck 公司;重組人UGT1A1*1 和UGT1A1*6 利用本課題組昆蟲表達系統(tǒng)表達和制備。

        超高效液相色譜QTRAP 6500 三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國AB SCIEX),配有離子源是電噴霧離子化源(ESI)和Analyst 1.4.2 數(shù)據(jù)處理軟件。AUY120 電子天平來自日本島津公司; 可調(diào)速渦旋混合器來自Scientific Industries 公司;恒溫混勻儀(Thermo Mixer C)來自德國艾本德公司;小型臺式冷凍離心機(Centrifuge 5424 R)來自德國艾本德公司。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 溶液配制 用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配制40 mmol/L 紫草素儲備液,于-20°C 保存;用DMSO 將上述儲備液稀釋為紫草素濃度分別為0.2、1、2、5、10、50 和100 μmol/L 的工作液待用。UDP GA 用Tris-HCl 緩沖液(50 mmol/L,pH=7.4)稀釋成濃度為50 mmol/L 的儲備液,于-80°C 保存待用。氯化鎂工作液(100 mmol/L)用超純水配制,4°C 保存待用,保存時間不超過4 h。傘形酮(內(nèi)標)用乙腈配制成2 μmol/L 的工作液,放置于4°C 待用。SN-38 用DMSO配制成濃度為500 μmol/L 和600 μmol/L 的工作液備用,-20℃冰箱長期避光保存。

        1.2.2 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS) 分析條件 使用本課題組已建立的UPLC-MS/MS 方法定量檢測SN-38葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物SN-38G 的生成速率。色譜和質(zhì)譜方法簡單描述如下:待分析樣品進樣2 μl 后,使用流動相A(水,含0.1%甲酸)和流動相B(乙腈,含0.1%甲酸)于35℃下采用BEH Ccolumn(50 mm×2.1 mm,1.7 μm Waters 公司,Milford,MA) 色譜柱梯度洗脫分離。洗脫梯度條件為0~2 min,5%的流動相B;2.0~2.4 min,5%→50%的流動相B;2.4~3.0 min,50%的流動相B;3~4 min,50%→5%的流動相B;4~5 min,5%的流動相B。基于多反應監(jiān)測(multiple-reaction monitoring,MRM)模式下,ESI 電離串聯(lián)質(zhì)譜法進行待測樣品的檢測。ESI 源參數(shù):噴霧電壓為5 500 V;碰撞氣為medium;離子源霧化器為35 psi;加熱輔助器為30 psi;氣簾氣為30 psi;停留時間為100 msc;離子傳輸毛細管溫度為500℃;傘形酮去簇電壓為42 V,碰撞能為31 V);SN-38G(去簇電壓為20 V,碰撞能為45 V)。SN-38G 的母離子和子離子質(zhì)荷比(m/z)分別為569.2和393.2。傘形酮(內(nèi)標)的母離子和子離子m/z 分別為163.1 和107.1。

        1.2.3 紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6 催化SN-38葡萄糖醛酸化反應的抑制作用 SN-38 分別與濃度為0、1、10 和100 μmol/L 的紫草素在氯化鎂(10 mmol/L)、Tris-HCl(50 mmol/L,pH 7.4)和UGT1A1*1 或UGT1A1*6(5.2 nmol/L) 存在的條件下于37℃預孵育5 min 后,加入10 μL UDPGA(2.5 mmol/L 起始反應)。反應體系總體積為200 μL,其中有機溶劑(DMSO)最終濃度為1% (v/v)。SN-38 的終濃度接近其被UGT1A1 代謝的K值,UGT1A1*1 組為2.5 μmol/L,UGT1A1*6 組為3 μmol/L。37℃反應30 min 后,加入等體積4℃預冷的乙腈(含2 μmol/L 內(nèi)標傘形酮)終止反應。待測樣品在4°C 下以20 500×g 離心30 min,取上清。UPLCMS/MS 檢測SN-38G 濃度。所有實驗均重復3 次。

        1.2.4 紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6 催化SN-38代謝抑制的半抑制濃度 (half-maximal inhibitory concentration,IC) 濃度梯度為0、0.2、1、2、5、10、50 和100 μmol/L 的紫草素分別與SN-38 在氯化鎂(10 mmol/L)、Tris-HCl(50 mmol/L,pH 7.4)和UGT1A1*1 或UGT1A1*6(5.2 nmol/L)存在的條件下,于37℃預孵育5 min 后,加入UDPGA(2.5 mmol/L)起始反應。反應體系總體積為200 μl,其中有機溶劑(DMSO)最終濃度為1%(v/v)。SN-38 的終濃度接近其被UGT1A1 代謝的K值,UGT1A1*1 組為2.5 μmol/L,UGT1A1*6 組為3 μmol/L。37℃反應30 min 后加入200 μl 含內(nèi)標(傘形酮濃度為2 μmol/L)的乙腈終止反應。樣品在4℃條件下用20 500 r/min離心30 min 去除蛋白沉淀,UPLC-MS/MS 檢測上清中SN-38G 的含量。使用GraphPad prism 7.0 對剩余酶活性與藥物濃度之間的關(guān)系繪圖,獲得相應的IC。所有實驗均重復3 次。

        1.3 統(tǒng)計學方法

        2 結(jié)果

        2.1 紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6 催化SN-38葡萄糖醛酸化反應的抑制作用

        紫草素可抑制UGT1A1 催化的SN-38 葡萄糖醛酸化反應。當其濃度為1、10 和100 μmol/L 時,UGT1A1*1催化SN-38 葡萄糖醛酸化的反應速率均低于對照組(未加紫草素)的反應速率,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖1A)。而且隨著紫草素濃度的升高,UGT1A1*1催化的SN-38 葡萄糖醛酸化反應速率降低,1、10和100 μmol/L 紫草素組的反應速率分別為對照組的80.044%、29.318%和4.906%,各組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖1A)。相似的,對于UGT1A1*6 催化的SN-38 葡萄糖醛酸化反應,紫草素濃度在1 至100 μmol/L 范圍也可顯著抑制SN-38G 的生成。紫草素在1、10 和100 μmol/L 濃度下SN-38 代謝產(chǎn)物(SN-38G)的生成速率均低于對照組(未加紫草素)的生成速率,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖1B)。同時,隨著紫草素濃度的升高,UGT1A1*6 催化的SN-38G 的生成速率降低,1、10 和100 μmol/L 紫草素組中的反應速率分別為對照組的86.462%、43.145%和5.248%,且各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖1B)。紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6 催化SN-38 葡萄糖醛酸化的抑制作用均隨紫草素濃度的升高而增強。

        圖1 不同濃度的紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6 催化的SN-38G 生成速率的影響

        2.2 紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6 催化SN-38代謝抑制的IC50

        在進一步定量分析紫草素對UGT1A1 催化SN-38 葡萄糖醛酸化的研究中發(fā)現(xiàn),在0.2~100 μmol/L內(nèi),紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6 均表現(xiàn)出了隨著紫草素濃度升高而增強的抑制作用,IC值分別為4.357 μmol/L 和7.353 μmol/L(圖2)。紫草素對UGT1A1*1和UGT1A1*6 催化的SN-38 葡萄糖醛酸化均具有抑制作用。

        圖2 紫草素對UGT1A1*1(A)和UGT1A1*6(B)催化的SN-38 葡萄糖醛酸化反應活性的抑制作用

        3 討論

        目前草藥或其主要活性成分和西藥間的相互作用被廣泛關(guān)注,已有報道證實了部分草藥可能通過抑制藥物代謝酶而引發(fā)草藥-藥物相互作用。UGT1A1是人體內(nèi)代謝伊立替康活性代謝產(chǎn)物SN-38 的關(guān)鍵酶,多種影響因素例如其基因單核苷酸多態(tài)性或同服藥物相互作用等皆可影響UGT1A1 酶的活性,進而導致體內(nèi)過度蓄積伊立替康活性代謝產(chǎn)物SN-38,引發(fā)中性粒細胞減少、腹瀉等不良反應。值得注意的是,在人和大鼠肝微粒體的體外研究中發(fā)現(xiàn),紫草素也可抑制UGT1A1 催化的β-雌二醇-3-葡萄糖醛酸化。該結(jié)果表明紫草素是UGT1A1 的抑制劑,提示了伊立替康與含紫草素的制劑聯(lián)合使用時,紫草素可能會通過抑制UGT1A1 活性,進而增加SN-38 血藥濃度并導致伊立替康不良反應的發(fā)生。但目前尚無定量研究評價紫草素是否抑制SN-38 的葡萄糖醛酸化,是否存在引發(fā)草藥-藥物相互作用的風險。

        本研究發(fā)現(xiàn)紫草素對野生型UGT1A1(即UGT1A1*1)催化SN-38 的葡萄糖醛酸化存在抑制作用,且該抑制作用隨紫草素濃度的升高而增強,IC值為4.357 μmol/L。中藥對藥物代謝酶的抑制程度可以分為強抑制、中等抑制和弱抑制,當IC值小于10 μmol/L時為強抑制,IC值在10~50 μmol/L 之間為中等抑制,IC值大于50 μmol/L 時為弱抑制。根據(jù)本研究結(jié)果,紫草素對野生型UGT1A1 存在強抑制作用,當含紫草素的制劑與伊立替康同服時,需注意引發(fā)草藥-藥物相互作用的風險。

        UGT1A1*6 這種UGT1A1 編碼區(qū)突變的突變體在亞洲人群中出現(xiàn)頻率較高(為16%~40%),該突變會導致SN-38 的代謝清除降低。研究發(fā)現(xiàn)紫草素對UGT1A1*6 也存在較強的抑制作用,IC值為7.353 μmol/L,盡管該值高于對UGT1A1*1 抑制的IC,對其抑制作用弱于UGT1A1*1,但仍處在強抑制作用范圍內(nèi)。此外,臨床研究發(fā)現(xiàn),基因型為UGT1A1*6純合突變的個體SN-38 存在約二倍的血漿濃度-時間曲線下面積(area under the plasma concentrationtime curve,AUC)升高。因此,基因型為UGT1A1*6的患者服用紫草素制劑會進一步增加SN-38 的血藥濃度,造成因SN-38 在體內(nèi)的過多積累,存在進一步加重伊立替康不良反應的風險。因此,聯(lián)合使用紫草素制劑與伊立替康時更需注意患者的基因型,以免引發(fā)不良發(fā)應。

        綜上所述,紫草素與伊立替康共同服用時,可能通過抑制UGT1A1 催化的SN-38 的代謝,從而增加SN-38 的血藥濃度,存在引發(fā)草藥-藥物相互作用的風險。紫草素對UGT1A1*1 和UGT1A1*6 的抑制均屬于強抑制作用,但對前者的抑制作用更強。同時考慮到UGT1A1*6 純合基因型患者本身SN-38 代謝清除降低,對此類基因型聯(lián)用紫草素制劑和伊立替康更需注意草藥-藥物相互的潛在風險。本研究結(jié)果為科學指導紫草素制劑和伊立替康合理聯(lián)用提供理論基礎(chǔ),避免因UGT1A1 抑制而導致的藥物不良反應的發(fā)生,具有重要參考的價值。

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