孔夢(mèng)潔，耿永琪，楊 磊，秦永斌，黃曉宇,2*，滾雙寶,2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070）

合作豬又被稱為蕨麻豬、山豬，具有適應(yīng)高海拔惡劣環(huán)境、抗寒、抗病、耐粗飼等特點(diǎn)，個(gè)體較小，體軀較短，四肢結(jié)實(shí)緊湊，周身被毛黑色，少數(shù)出現(xiàn)棕色。寒冷季節(jié)，合作豬身上會(huì)長(zhǎng)出棕色絨毛，溫暖炎熱季節(jié)身上絨毛退化，直至消失，這種現(xiàn)象可能與合作豬周期性生長(zhǎng)絨毛以抵御寒冷環(huán)境，從而適應(yīng)高海拔高寒地區(qū)的環(huán)境有關(guān)。因此，探究合作豬絨毛生長(zhǎng)相關(guān)基因?qū)τ谘芯亢献髫i的抗寒性能具有重要意義。

β-catenin基因是機(jī)體內(nèi)一種重要的功能蛋白，可與很多蛋白相互結(jié)合形成復(fù)合體[1-2]。其遍布動(dòng)物體各個(gè)結(jié)構(gòu)中，功能十分豐富，且在動(dòng)物進(jìn)化過程中非常保守。截至目前，主要在動(dòng)物間質(zhì)組織和上皮組織中發(fā)現(xiàn)了β-catenin基因的存在。研究證實(shí)，β-catenin基因在毛發(fā)生長(zhǎng)中具有調(diào)節(jié)作用。當(dāng)β-catenin基因發(fā)生突變或被敲除后，存在于動(dòng)物體皮膚中的毛囊則不會(huì)繼續(xù)發(fā)育，而補(bǔ)償缺失的β-catenin基因后，毛囊又會(huì)長(zhǎng)出新的毛發(fā)，這充分說明β-catenin基因在毛囊生長(zhǎng)發(fā)育過程中是必須存在的[3-4]。還有研究表明，在毛囊的發(fā)生發(fā)育過程中β-catenin基因會(huì)被激活，以此促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，從而促進(jìn)毛囊結(jié)構(gòu)的發(fā)生發(fā)育[5]。此外，Plikus等[6]以小鼠皮膚組織作為模型探究毛囊膨出處的毛干細(xì)胞調(diào)控機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)β-catenin基因在炎熱與寒冷環(huán)境下分別表現(xiàn)為高活性和低活性，說明其在毛干細(xì)胞調(diào)控過程中與溫度變化呈正相關(guān)。目前關(guān)于β-catenin基因的研究主要是圍繞人體β-catenin基因開展，而關(guān)于豬β-catenin基因及其在絨毛生長(zhǎng)發(fā)育過程中的研究鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)以夏季和冬季的合作豬皮膚組織為研究材料，通過qRT-PCR探究β-catenin基因在合作豬絨毛生長(zhǎng)過程中的表達(dá)特征及作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究以甘南州迭部縣8月齡合作豬為研究對(duì)象，在夏季極熱和冬季極冷的時(shí)間點(diǎn)采集5 cm×1 cm的豬皮膚。具體采集頸部、肩部、側(cè)部、臀部等組織樣品作為本次試驗(yàn)樣品。

1.1.2 主要試劑、耗材 Trizol新型RNA抽提劑、2*Taq PCR MasterMix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTP Mixture、Oligo dT Primer、RNase Inhibitor、DNA凝膠回收試劑盒等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 在夏季極熱和冬季極冷時(shí)間點(diǎn)分別選擇健康的8 月齡合作豬各20 頭。將兩組試驗(yàn)對(duì)象宰殺后，在無(wú)菌條件下采集其頸部、肩部、側(cè)部、臀部等部位大小為5 cm×1 cm的皮膚組織樣品備用，將樣品在液氮中快速冷凍，放到-80 ℃冰箱存放。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 以GenBank中的豬β-catenin基因核苷酸序列為參考，運(yùn)用NCBI中的Primer Premier 5.0和Primer-BLAST工具，按照定量引物設(shè)計(jì)的一般原則，設(shè)計(jì)本次實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析試驗(yàn)所需的特異性引物，并由陜西中科羽瞳生物科技有限公司合成，引物信息如表1所示。

表1 引物信息

1.2.3 RNA提取與cDNA模板合成 采用Trizol試劑抽提合作豬仔豬的臀部、側(cè)部、肩部和頸部等部位組織的RNA，分別運(yùn)用凝膠電泳法、分光光度計(jì)法檢測(cè)所抽提的RNA（驗(yàn)證完整性和純度），將得到的cDNA放到-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分別以不同部位組織的cDNA為模板，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用qRT-PCR檢測(cè)β-catenin基因在合作豬臀部、側(cè)部、頸部和肩部等組織的表達(dá)量。qRTPCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件分別見表2、表3。為減少試驗(yàn)誤差，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表2 qRT-PCR反應(yīng)體系

表3 qRT-PCR反應(yīng)條件

2 結(jié)果與分析

2.1 β-catenin基因擴(kuò)增曲線

從β-catenin基因的擴(kuò)增曲線可以看出（圖1），雖然曲線在平臺(tái)期有所變化，但在指數(shù)增長(zhǎng)區(qū)域的重復(fù)性非常好，說明適宜進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的定量分析。

圖1 β-catenin基因的擴(kuò)增曲線

2.2 β-catenin基因溶解曲線

如圖2所示，β-catenin基因的溶解曲線峰形為單一窄峰，無(wú)雜峰出現(xiàn)，說明該試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物特異性良好，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)分析。

圖2 β-catenin基因的溶解曲線

2.3 β-catenin基因在不同組織中的表達(dá)

通過qRT-PCR檢測(cè)合作豬各組織中β-catenin基因的表達(dá)水平（表4、圖3），發(fā)現(xiàn)合作豬4個(gè)部位中β-catenin基因的表達(dá)量夏季均高于冬季，說明β-catenin基因的表達(dá)量與溫度變化呈正比。此外，冬季合作豬β-catenin基因在肩部（0.85±0.13）和臀部（0.79±0.14）的表達(dá)量相比側(cè)部（0.62±0.11）和頸部（0.50±0.077）要高，而夏季肩部（0.85±0.14）和臀部（0.89±0.0071）較側(cè)部（1.00±0.08）和頸部（0.92±0.091）的表達(dá)量低，說明合作豬肩部和臀部的β-catenin基因隨著溫度變化表達(dá)量較為恒定，而側(cè)部和頸部的β-catenin基因表達(dá)量隨溫度變化起伏較大。以上結(jié)果表明，合作豬β-catenin基因與溫度變化呈正相關(guān)，但隨著溫度的變化，肩部和臀部的β-catenin基因表達(dá)較為恒定，這或許是冬季合作豬肩部和臀部絨毛生長(zhǎng)的原因之一，但具體分子調(diào)控機(jī)制還有待研究。

表4 熒光定量分析結(jié)果

圖3 β-catenin基因在合作豬夏、冬季節(jié)不同組織中的表達(dá)水平

3 討論

毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育依靠多種信號(hào)分子的共同作用，其中大部分的信號(hào)分子屬于Wnt信號(hào)通路以及一些其他傳導(dǎo)通路和因子等。上皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞受到這些信號(hào)分子的共同作用，促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化，并最終形成毛囊結(jié)構(gòu)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路與分子激活在毛囊的生長(zhǎng)和發(fā)育中起著重要的調(diào)節(jié)作用[7]。β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的主要調(diào)控蛋白中的一種，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用[8]。β-catenin基因是毛發(fā)生成過程中的重要存在，其突變會(huì)導(dǎo)致毛囊基板的產(chǎn)生被阻斷，敲除毛囊中β-catenin基因會(huì)導(dǎo)致毛發(fā)掉落[9]。目前關(guān)于β-catenin基因的研究主要是圍繞人體β-catenin基因開展，而關(guān)于豬β-catenin基因及其在絨毛生長(zhǎng)發(fā)育過程中的相關(guān)研究較少。

動(dòng)物絨毛的生長(zhǎng)是季節(jié)性變化的，大部分動(dòng)物皮膚表層會(huì)在秋冬季節(jié)長(zhǎng)出絨毛，依靠絨毛的防寒性能抵御寒冷[10]。季節(jié)性換毛是動(dòng)物為了應(yīng)對(duì)環(huán)境溫度的變化所作出的適應(yīng)性反應(yīng)[11]。合作豬絨毛的生長(zhǎng)同樣具有季節(jié)性，秋季新生絨毛生長(zhǎng)出體表，秋冬季快速生長(zhǎng)，冬春寒冷季節(jié)絨毛密度達(dá)到最大，以此抵御寒冷環(huán)境氣候。本試驗(yàn)利用qRT-PCR方法檢測(cè)了夏冬兩季合作豬頸部、肩部、體側(cè)和臀部皮膚組織中β-catenin基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)β-catenin基因的表達(dá)量夏季高于冬季，且頸部和側(cè)部中β-catenin基因的表達(dá)量夏季顯著高于冬季（P＜0.05），但肩部和臀部中β-catenin基因的表達(dá)量隨溫度變化較為恒定。以上結(jié)果與Plikus等[6]對(duì)β-catenin基因在不同季節(jié)小鼠皮膚中的變化規(guī)律結(jié)果相一致，即合作豬皮膚中β-catenin基因的mRNA表達(dá)量與溫度變化呈正相關(guān)。在整個(gè)絨毛生長(zhǎng)過程中，β-catenin基因的mRNA表達(dá)量在夏冬兩季存在差異，尤其在冬季絨毛生長(zhǎng)發(fā)育最迅速的時(shí)期，其表達(dá)量在頸部和側(cè)部顯著降低，但肩部和臀部的表達(dá)量與夏季相比較為恒定，表明β-catenin基因的表達(dá)可能調(diào)控絨毛的發(fā)生[12-13]，同時(shí)β-catenin基因?qū)γ腋杉?xì)胞分化起作用[6]，從而影響絨毛生長(zhǎng)，但具體調(diào)控機(jī)制還有待研究。

4 結(jié)論

通過檢測(cè)夏季和冬季β-catenin基因在合作豬豬體中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)合作豬β-catenin基因在頸部與側(cè)部中的表達(dá)量夏季顯著高于冬季（P＜0.05）。因此推測(cè)β-catenin基因與合作豬周期性絨毛生長(zhǎng)有關(guān)。本研究結(jié)果可為探索合作豬絨毛生長(zhǎng)調(diào)控分子機(jī)制和毛發(fā)周期性生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。