王婷，張正雷，孫田華，張幸子，王彩霞，席仲興，焦 磊

（蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司，甘肅 蘭州 730046）

布魯氏桿菌（以下簡稱布氏菌）是革蘭氏陰性胞內(nèi)寄生菌[1]。布氏菌病是一種由布氏菌引起的人畜共患慢性細(xì)菌性傳染病。該病在世界各國廣泛流行，嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展。因此，快速準(zhǔn)確的診斷是控制該病的關(guān)鍵[2]。

細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)是最可靠的布氏菌病檢測方法，是檢測布氏菌病的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。但布氏菌的分離培養(yǎng)對實(shí)驗(yàn)室要求較高，培養(yǎng)周期長[4]，且該方法受很多因素影響導(dǎo)致陽性檢出率較低，所以布氏菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷多采用免疫學(xué)方法。最常用的有試管凝集試驗(yàn)（SAT）和虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）[5]，兩者具有操作簡單、實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡易的優(yōu)點(diǎn)，是我國目前常用的檢測布氏菌病的方法，缺點(diǎn)是結(jié)果判定主觀性較強(qiáng)、檢測時(shí)間長、易出現(xiàn)漏檢或假陽性[6]。而膠體金免疫層析法對樣本檢測量需求少、操作方便、反應(yīng)時(shí)間短，適合于廣大基層現(xiàn)場及大量檢測樣本的快速初篩[7]。

BP26抗原是一種強(qiáng)免疫原性的細(xì)胞間質(zhì)蛋白，以其為檢測抗原檢測布氏菌病的準(zhǔn)確率可達(dá)90%以上[8]。本研究基于BP26抗原并采用膠體金免疫層析法研制出布氏菌病診斷試劑盒，以期用于布氏菌病的快速檢測，尤其是基層對該病的初篩。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 抗原及血清 重組布氏菌BP26抗原和兔抗BP26多抗血清均為蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司制備。多抗血清由抗原免疫家兔制備。

1.1.2 儀器設(shè)備 HM3035型XYZ三維劃膜噴金儀、CT300型自動(dòng)裁條機(jī)均為上海金標(biāo)生物科技有限公司產(chǎn)品，CM4000型切條系統(tǒng)為BIODOT產(chǎn)品，SORVALL RC-6 plus型離心機(jī)、Biofuge Primo R型離心機(jī)均為ThermoFisher產(chǎn)品，UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)為日本島津公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑及材料 氯金酸（HAuCl4·3H2O）、PEG20000、檸檬酸三鈉（C6H5Na3O7·2H2O）均為Sigma公司產(chǎn)品，其他試劑均為國產(chǎn)。硝酸纖維素膜（德國SARTORIUS UniSart CN140），吸水濾紙（Whatman），聚酯纖維膜（VL98）、PVC板、干燥劑均為國產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 制備膠體金溶液 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液。配制新鮮的1%氯金酸溶液及1%檸檬酸三鈉溶液備用，在500 ml蒸餾水中加入5 ml 1%氯金酸溶液煮至沸騰，再迅速一次性加入9 ml新配制的1%檸檬酸三鈉溶液，混勻，繼續(xù)煮沸，直至溶液呈現(xiàn)透明的酒紅色，待冷卻，4 ℃保存?zhèn)溆?。觀察膠體金溶液的物理性狀，采用紫外可見分光光度計(jì)在波長400～600 nm范圍內(nèi)對制備的膠體金溶液進(jìn)行掃描，測定其最大吸收峰值。

1.2.2 膠體金溶液標(biāo)記BP26抗原的最佳標(biāo)記pH確定 配制pH 6.0～8.0的磷酸鹽緩沖液，每隔0.2個(gè)pH為一個(gè)結(jié)合梯度，每管先加入100 μl磷酸鹽緩沖液，再加入30 μl BP26抗原，振蕩混勻，室溫下靜置反應(yīng)20 min，再加入200 μl 10% NaCl溶液終止反應(yīng)，觀察顏色變化，顏色保持不變的最低pH，即為膠體金溶液標(biāo)記BP26抗原的最佳標(biāo)記pH。

1.2.3 膠體金溶液標(biāo)記BP26抗原的最佳標(biāo)記抗原量確定 準(zhǔn)備1.5 ml離心管若干，分別加入已調(diào)整為最佳標(biāo)記pH的磷酸鹽緩沖液及膠體金溶液，各管加入BP26抗原量從6 μl至44 μl，每管間隔2 μl，振蕩混勻，室溫靜置反應(yīng)20 min。然后每孔加入200 μl 10% NaCl溶液，觀察顏色變化，顏色保持不變的最小抗原量，即為膠體金溶液標(biāo)記BP26抗原的最佳標(biāo)記抗原量。

1.2.4 金標(biāo)BP26抗原的制備 用氯金酸制備0.01%膠體金溶液，用已確定為標(biāo)記BP26抗原的最佳p H 的磷酸鹽緩沖液，再根據(jù)已確定的最佳標(biāo)記量加入相應(yīng)量的BP26抗原，用磁力攪拌器緩慢混勻，再加入0.05%的PEG20000后繼續(xù)攪拌30 min。4 ℃條件下4000 r/min離心30 m i n，棄沉淀；上清液在4 ℃條件下9500 r/min離心45 min，小心吸取沉淀，沉淀用pH 6.7的磷酸鹽緩沖液重懸，即為金標(biāo)BP26抗原，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 布氏菌BP26抗原膠體金試劑盒的組裝硝酸纖維素膜（NC膜）上檢測線（T線）包被BP26抗原，質(zhì)控線（C線）包被兔抗BP26多抗，膠體金結(jié)合墊鋪上金標(biāo)BP26抗原，將膠體金結(jié)合墊、樣品墊、包被XT線和C線的NC膜、吸水濾紙依次固定于PVC底板上，裁切成0.42 cm ×5 cm條狀，裝入特制的塑料卡盒內(nèi)，再裝入有干燥劑的鋁箔袋中密封，即為用于檢測布氏菌病的膠體金檢測試劑盒。

1.2.6 膠體金試劑盒的判定方法 樣品加量為100 μl，反應(yīng)時(shí)間為15 min，T線和C線均顯示紅色條帶判定為陽性；T線不顯示紅色條帶，C線顯示紅色條帶時(shí)判為陰性；C線不顯示紅色條帶判為試劑盒失效。

1.2.7 試劑盒的兔多抗血清檢測及重復(fù)性檢測 使用3批試劑盒檢測布氏菌兔抗BP26多抗血清，血清稀釋倍數(shù)為1∶10000倍，通過試驗(yàn)結(jié)果判定試劑盒的靈敏度和重復(fù)性效果。

2 結(jié)果

2.1 膠體金溶液的制備

制備的膠體金溶液外觀呈酒紅色，經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)掃描發(fā)現(xiàn)其吸收峰在525 nm處，峰型狹窄，說明該膠體金顆粒均一，分散性好（圖1）。

圖1 膠體金溶液的紫外可見分光光度計(jì)掃描光譜圖

2.2 膠體金溶液標(biāo)記BP26抗原的最佳標(biāo)記pH確定

經(jīng)試驗(yàn)確定，最佳標(biāo)記pH為6.7。

2.3 膠體金溶液標(biāo)記BP26抗原的最佳標(biāo)記抗原量確定

試驗(yàn)測得加入BP 26 抗原最低穩(wěn)定量為16 μl/0.9 ml膠體金（BP 26 抗原蛋白含量為1.24 μg/μl），則最佳標(biāo)記量為20 μl。

2.4 試劑盒的兔血清檢測及重復(fù)性檢測

使用3批試劑盒檢測布氏菌兔抗BP26多抗血清，檢測結(jié)果一致，說明試劑盒的重復(fù)性良好（圖2）。

圖2 兔抗BP26多抗血清檢測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

膠體金免疫層析技術(shù)具有便捷、特異敏感、穩(wěn)定性強(qiáng)、對設(shè)備要求不高、肉眼即可快速判定結(jié)果等特點(diǎn)，特別適合基層現(xiàn)場的快速初篩和應(yīng)用[6,9]。BP26抗原為布氏菌細(xì)胞間質(zhì)蛋白，作為布氏菌病血清學(xué)檢測診斷抗原具有較好的特異性和較高的靈敏度[10]。本研究基于BP26抗原并采用雙抗原夾心法建立了布魯氏菌BP26抗原膠體金試劑盒，即將重組的布氏菌外膜蛋白BP26作為膠體金標(biāo)記物，金標(biāo)BP26抗原作為檢測線（T線）及抗BP26兔多克隆抗體作為質(zhì)控線（C線），該檢測試劑盒操作簡便，15 min即可檢測出結(jié)果，樣本用量少，操作過程污染機(jī)會少，且成本低廉，故可作為布氏菌病的初篩方法。