赫英姿 宋 策 于庭洪 賈 姝 趙 翀 左玲玲

(遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所 遼寧 鳳城 118100)

柞蠶核型多角體病毒是柞蠶膿病的病原微生物，在烈日曝曬(44.3～48.7 ℃)3 d以上能失活，經(jīng)100 ℃沸水煮5 min，可以完全失活[1]。柞蠶微粒子孢子是柞蠶微粒子病的致病菌，在干熱100 ℃條件下30 min,或濕熱100 ℃條件下10 min，0.1 MPa高壓條件下30 min，均可失活[2]。柞蠶鏈球菌是柞蠶空胴病的致病菌，柞蠶鏈球菌100 ℃蒸汽處理5 min失活，干熱處理60 min失活，高壓(0.05～ 0.1 MPa)蒸汽處理5 min失活[3]。塞氏桿菌是柞蠶敗血病致病菌，是一種短桿菌，活菌大小約為(0.98～1.34)μm×(2.94～4.22)μm，有周生鞭毛，能運動，革蘭氏陰性，不形成芽孢。塞氏桿菌又名靈菌，能產(chǎn)生紅色的“靈菌素”，菌落玫瑰紅色，半透明。關(guān)于賽氏桿菌的抵抗性尚未見報道，為此，本文進(jìn)行了賽氏桿菌的自然抵抗性和幾種物理滅菌方法的試驗研究。

1 材料與方法

1.1 菌液的制備

將本實驗室保存的柞蠶敗血病致病菌塞氏桿菌菌株活化，用LB固體斜面培養(yǎng)基37 ℃條件下培養(yǎng)24 h做為供試菌，每支試管加2 mL無菌水洗脫。將菌液倒入1.8cm×18cm試管中，用振蕩器振蕩均勻。用血球計數(shù)板計算菌液濃度為7.0×106 mL-1。取50 μL菌液于載玻片上，用無菌玻璃棒涂抹均勻，陰干備用。

1.2 自然抵抗性測試

1.2.1 室內(nèi)光線的影響

取上述載玻片上14片，7片置于實驗臺上見光，另外7片置于試驗柜內(nèi)避光，分別于不同時間后接種于平面培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)，觀察、判斷病菌是否失活。

1.2.2 野外光線的影響

在柞樹葉片表面和背面分別涂抹菌液，樹上溫度計顯示32 ℃，分別于0.5 h、1 h、2 h、3 h后接種。37 ℃條件下培養(yǎng)，觀察、判斷病菌是否失活。

1.2.3 陽光照射的影響

將涂菌載玻片置于地面陽光下，地表溫度42～34 ℃。分別于0.5 h、1 h、2 h、3 h后接種于平面培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)，觀察、判斷病菌是否失活。

1.3 滅菌方法試驗

1.3.1 紫外線照射

涂菌載玻片陰干后置于30 W紫外燈下40cm處照射，照射時的溫度為24 ℃。分別于照射1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h后將菌液接種到平板培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)，依據(jù)文獻(xiàn)[3]中的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，觀察、判斷病菌是否失活。

1.3.2 高溫干熱處理

涂菌載玻片陰干后置于干燥箱中，100 ℃條件下分別于處理10 min、20 min、1 h后，接種于平面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件同上。

1.3.3 高壓蒸汽處理

涂菌載玻片陰干后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，不與水接觸，相同壓力下分別于處理3 min、5 min、10 min后，接種于平面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件同上。

1.3.4 高溫蒸汽處理

涂菌載玻片陰干后置于蒸鍋中，鍋中水始終保持沸騰狀態(tài)，但不與載玻片接觸。分別于處理3 min、5 min、10 min后，接種于平面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件同上。

1.3.5 恒溫水浴處理

將2 mL菌懸液加人試管后置于水浴鍋中，在60 ℃、65℃、70 ℃條件下處理5 min、20 min、1 h后，用接種環(huán)將處理后的菌懸液接種于平面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)光線影響情況

由表1結(jié)果可以看出，塞氏桿菌自然存活時間較短，且對光線敏感。涂菌載玻片見光處4 d失活，避光處7 d失活。

表1 涂菌載玻片明亮、避光放置失活情況

2.2 室外葉片失活情況

由表2結(jié)果可以看出，賽氏桿菌在室外柞葉表面較快失活。葉表3 h，葉背4 h，接種培養(yǎng)沒有菌落長出。葉表溫度為32 ℃。

表2 涂菌葉表、葉背失活情況

2.3 日光直射的影響效果

由表3結(jié)果看出，賽氏桿菌對光線敏感，日光直射下1 h就失活。地表溫度40 ℃。

表3 日光下照射不同時間失活情況

2.4 紫外線照射的滅菌效果

賽氏桿菌對紫外線敏感，30 W紫外燈于0.4 m距離處照射3 h使其失活。

表4 紫外線照射不同時間失活情況

2.5 高溫干熱處理、高壓蒸汽處理、常壓蒸汽處理、高溫水浴處理的失活情況

賽氏桿菌對高溫、高壓、蒸汽的耐受能力較弱，經(jīng)過8 d的接種培養(yǎng)表明：高溫干熱100 ℃處理10 min失活；高壓( 0.05～ 0.1 MPa) 蒸汽處理3 min即可失活；常壓蒸汽處理5 min即可失活；高溫( 70 ℃)水浴處理5 min即可失活，而在60 ℃水浴中處理5 min尚不失活。

3 討 論

塞氏桿菌是導(dǎo)致柞蠶發(fā)生敗血病的致病菌之一，試驗結(jié)果表明其自然抵抗性較弱，通過普通的物理方法就可以將其殺死，因而該菌的利用，則需要在使用前配置菌液，以免菌體失活。養(yǎng)蠶實踐中為避免該菌的為害，養(yǎng)蠶用具及環(huán)境只要提前一周洗刷晾干備用即可，養(yǎng)蠶室配合紫外燈使用。

塞氏桿菌在普通細(xì)菌培養(yǎng)基上所形成的菌落為玫瑰紅色，即靈菌紅素。靈菌紅素是一類含甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu)的天然色素，是一些放線菌、沙雷菌及其他細(xì)菌的次級代謝產(chǎn)物，具有免疫抑制、抗細(xì)菌、抗真菌和抗瘧疾等多種生物活性。靈菌紅素有很強的抗腫瘤及免疫抑制活性，目前主要由一些微生物產(chǎn)生，也可以通過全合成制得，對于微生物資源及發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)化一直在研究之中[4-5]。在靈菌紅素的生產(chǎn)中目前還沒有人利用柞蠶蛹篩選高產(chǎn)菌株以及相應(yīng)的靈菌紅素生物活性物質(zhì)。筆者在試驗中得知：靈菌在柞蠶幼蟲和成蟲之間通過體壁創(chuàng)傷的方式很容易傳染，而且感染率很高[6]，柞蠶幼蟲及蛹尸體內(nèi)的靈菌在4 ℃冰箱經(jīng)過6個月仍然具有活性，由此認(rèn)為柞蠶作為生產(chǎn)靈菌紅素的昆蟲資源是可以利用的。因此，研究塞氏桿菌的自然抵抗性和物理滅菌方法，對開展該菌的利用研究很有必要。