楊濤 賈兆晉 宋冀東 王東 張春梅

1唐山市工人醫(yī)院（河北唐山 063000）；2唐山市婦幼保健院（河北唐山 063000）

深靜脈血栓形成作為嚴重威脅人類健康的常見周圍血管疾病，具有較高的發(fā)病率、致殘率與致死率，其在心腦血管疾病發(fā)病中位列第三，僅次于心肌梗死與腦卒中［1］。癌癥、外科手術、骨折、產(chǎn)褥期、口服避孕藥等，都是深靜脈血栓形成的常見危險因素［2-3］。目前臨床上預防深靜脈血栓形成主要通過口服或注射抗凝藥物，然而，抗凝藥物在應用中有許多的局限性，因為該類藥物主要是通過降低凝血水平來預防深靜脈血栓的形成；可是，深靜脈血栓的形成不僅與凝血系統(tǒng)有關，還與血管內膜損傷、炎癥損傷及血液流速具有密切的聯(lián)系［4］。

現(xiàn)代中醫(yī)根據(jù)發(fā)病機制將深靜脈血栓栓塞分為氣虛血瘀型、脾腎陽虛型及濕熱下注型，而“淤血”貫穿于深靜脈血栓的發(fā)生與發(fā)展，因而中醫(yī)內治方主要以“清熱利濕、活血通脈”為主，再輔以針灸、外敷、熏洗等外治或綜合療手段。淫羊藿苷是淫羊藿中淫羊藿總黃酮的主要成分，其具有降黏解聚、阻滯血瘀與預防血栓的作用，在心血管疾病中受到了廣泛關注［5-7］，但其作用機制還有待研究。本實驗主要觀察淫羊藿苷對靜脈血栓大鼠凝血功能、炎癥因子及纖溶系統(tǒng)的影響，進一步明確其作用機制，為中醫(yī)治療臨床預防與治療深靜脈血栓形成提供實驗室數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 淫羊藿苷（≥98% HPLC，南京廣潤生物制品有限公司），戊巴比妥鈉（北京智杰方遠科技有限公司），白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、組織型纖溶酶原激活劑（tissue plasminogen activator，tPA）、纖溶酶原激活劑抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）Elisa 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），電子天平（華志科學儀器有限公司），全自動凝血分析儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司），離心管（寧波拓普森科學儀器有限公司），Power SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒（北京雅安達生物技術有限公司），cNDA 逆轉錄試劑盒（廣州泛思生物科技有限公司），NF-κB p65、VCAM-1、TF、GAPDH 抗體（碧云天生物技術有限公司）。

實驗動物：10 周齡SD 大鼠54 只，雌雄各半，體質量（230±30）g，清潔級，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，使用許可SYXK（冀）2020-002。飼養(yǎng)于實驗動物房中，溫度22 ～25 ℃，空氣相對濕度50% ～65%，光暗循環(huán)周期為12 h/12 h，大鼠自由攝食、飲水。實驗過程中對動物的處理嚴格依照國家對醫(yī)學實驗動物的相關要求進行。

1.2 實驗分組 采用隨機數(shù)字表法將54只大鼠分為5 組，假手術組（n=10）、血栓組（n=14）、低劑量淫羊藿苷組（n=10）、中劑量淫羊藿苷組（n=10）、高劑量淫羊藿苷組（n=10），假手術組開腹后僅游離下腔靜脈，不給予結扎處理，其余4 組均進行靜脈血栓造模。

造模方法：參考以往研究方法［8］復制靜脈血栓模型。3%戊巴比妥鈉（1.2 mL/kg）腹腔注射麻醉實驗大鼠，將大鼠仰臥位固定于操作臺上，腹中部除毛，碘伏消毒后鋪巾，在劍突下腹正中做一長約6 cm 的切口，暴露腹腔，仔細游離左腎靜脈與下腔靜脈匯合處，將1 mL 注射器針頭與下腔靜脈平行放置，采用4-0 慕絲線結扎左腎靜脈下方的下腔靜脈，緩慢抽出針頭?？p合切口。術后腹腔注射青霉素10 萬U 預防感染。結扎24 h 后，從血栓組中隨機選擇4 只大鼠麻醉后處死，打開腹腔，解剖下腔靜脈見血栓形成，說明造模成功。

給藥方法：結扎1、24、48、72 h 后，低、中、高劑量淫羊藿苷組大鼠舌下靜脈注射10、20、40 mg/kg的淫羊藿苷溶液，假手術組、血栓組大鼠舌下靜脈注射1 mL/（kg·d）的生理鹽水，每種劑量給藥4 次。

1.3 血液學指標檢測 末次給藥1 h 后，頸總動脈采血，置于含枸櫞酸鈉溶液的離心管內，混勻后室溫下3 000 r/min 離心10 min，獲取上清液，采用全自動凝血分析儀檢測凝血功能指標部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、凝血酶時間（thrombin time，TT）、D-二聚體（D dimer，D-D）濃度。頸總動脈采血，置于普通離心管內靜置30 min，3 000 r/min 離心10 min，獲取上清液，-80 ℃保存，采用Elisa 法檢測上清液中炎癥因子IL-1β、TNF-α濃度，采用Elisa 法檢測上清液中tPA 和PAI-1 的濃度。Elisa 法檢測嚴格參照試劑盒說明書進行相應操作。

1.4 血栓重量檢測 處死大鼠后，完整取出兩結扎點之間的下腔靜脈，小心分離下腔靜脈內皮與血栓，取出血栓組織塊，洗去多余水分；隨后轉移至培養(yǎng)皿中，置于干燥器內室溫干燥24 h，稱重。計算血栓抑制率，血栓抑制率=（m血栓組重量-m實驗重量）/m血栓組重量×100%。

1.5 RT-PCR 檢測 取下腔靜脈血管組織，勻漿后提取組織總RNA，按照cNDA 逆轉錄試劑盒將血管組織RNA 逆轉錄為cDNA，反應條件為：37 ℃1 h，95 ℃3 min。以cNDA 為模板，按Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書配RT-PCR反應體系，反應條件，95 ℃3 min，93 ℃30 s，55 ℃45 s，共40 個循環(huán)。引物序列：（1）NF-κB p65，上游引物5′-CCGGAGCTGGAGAACAACAAG-3′，下游引物5′-GCACTGGCCGGAGCACACC-3′；（2）VCAM-1，上游引物5′-CCGCGAGCGGGAGCGCAT-3′，下游引物5′-GCCACATCAGCCAGGTTGTACACC-3′；（3）TF，上游引物5′-ACAAACTGTTTTGAAAATCCA-3′，下游引物5′-CGAGTCATTGCATACTGTCC-3′；（4）GAPDH，上游引物5′-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物5′-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3′。

1.6 Western blot 檢測 取100 mg 下腔靜脈血管組織，加入組織裂解液1 mL，勻漿，4 ℃下14 000×g離心10 min，獲取上清液。利用BCA 法檢測蛋白濃度。將蛋白樣本置入沸水中煮沸5 min，冷卻后置于-20 ℃冰箱內保存。配制分離膠、濃縮膠，拔梳子，加入蛋白樣品20 μL/孔，上層濃縮膠恒壓80 V電泳30 min，下層分離膠恒壓120 V 電泳100 min，轉至PVDF 膜上，轉膜50 ～100 min；洗膜3 次，置入5%BSA 中慢速封閉2 h，再次洗膜3 次，將膜浸泡于一抗（1∶1 000）中4 ℃孵育過夜，一抗分別為NF-κB p65、VCAM-1、TF、GAPDH；洗膜3 次，將膜浸泡于羊抗兔二抗（1∶500）中室溫孵育1 h；洗膜3 次，ECL 顯影。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計學軟件SPSS 23.0進行統(tǒng)計學處理，計量資料采取均數(shù)±標準差的表達方式，多組間比較進行單因素方差分析，兩組之間作獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 術后實驗動物一般情況 假手術組大鼠術后精神狀態(tài)良好，飲食、活動正常；血栓組大鼠術后飲食及活動量減少，下肢紅腫，皮溫增高，經(jīng)過藥物治療后上述癥狀逐漸好轉。假手術組大鼠術后精神狀態(tài)良好，飲食、活動正常；血栓組大鼠術后飲食及活動量減少，下肢紅腫，皮溫增高，經(jīng)過藥物治療后上述癥狀逐漸好轉。

2.2 大鼠血栓重量 5 組大鼠靜脈血栓大體觀見圖1。相較于血栓組，低、中、高劑量淫羊藿苷大鼠血栓干重量明顯下降（P＜0.05），并且中劑量組血栓干重量低于低劑量淫羊藿苷組（P＜0.05），高劑量淫羊藿苷組低于中劑量淫羊藿苷組（P＜0.05）。見表1。

圖1 大鼠靜脈血栓大體觀Fig.1 General view of venous thrombosis in rats

表1 大鼠血栓干重量Tab.1 Thrombus dry weight in rats ±s

表1 大鼠血栓干重量Tab.1 Thrombus dry weight in rats ±s

注：aP ＜0.05，vs.血栓組；bP ＜0.05，vs.低劑量淫羊藿苷組；c P ＜0.05，vs.中劑量淫羊藿苷組

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2.3 大鼠血液學指標檢測

2.3.1 凝血功能 相較于假手術組，血栓組APTT、PT、TT 減少（P＜0.05），D-D 濃度升高（P＜0.05）。相較于血栓組，低、中、高劑量淫羊藿苷組大鼠血清APTT、PT、TT 增加（P＜0.05），D-D 濃度降低（P＜0.05），并且該作用具有淫羊藿苷劑量依賴性，淫羊藿苷劑量越大作用越顯著。見表2。

表2 大鼠凝血功能指標Tab.2 Coagulation function indexes of rats ±s

表2 大鼠凝血功能指標Tab.2 Coagulation function indexes of rats ±s

注：aP ＜0.05，vs.血栓組；bP ＜.05，vs.低劑量淫羊藿苷組；cP ＜0.05，vs.中劑量淫羊藿苷組

分組假手術組血栓組低劑量淫羊藿苷組中劑量淫羊藿苷組高劑量淫羊藿苷組F值P值APTT（s）28.73±2.38a 14.94±3.15 17.08±2.21a 20.62±1.78b 24.85±2.19c 8.276 0.031 PT（s）14.54±0.27a 9.63±0.17 10.38±0.38 11.57±0.43b 13.64±0.51c 14.894 0.013 TT（s）22.66±2.16a 14.72±0.19 16.29±0.17a 18.56±0.11b 20.98±0.15c 17.235 0.011 D-D（μg/L）49.85±4.25a 132.09±9.17 103.08±5.61a 88.33±3.68b 65.19±1.27c 19.512 0.008

2.3.2 炎癥因子 相較于假手術組，血栓組IL-1β、TNF-α 濃度顯著升高（P＜0.05）；相較于血栓組，低、中、高劑量淫羊藿苷組IL-1β、TNF-α 濃度顯著降低（P＜0.05）；中劑量淫羊藿苷組IL-1β、TNF-α 濃度低于低劑量淫羊藿苷組（P＜0.05），高劑量淫羊藿苷組IL-1β、TNF-α 濃度低于中劑量淫羊藿苷組（P＜0.05）。見表3。

表3 5 組大鼠血清的炎癥因子與纖溶系統(tǒng)濃度Tab.3 Serum inflammatory factors and fibrinolytic system concentrations in 5 groups ±s

表3 5 組大鼠血清的炎癥因子與纖溶系統(tǒng)濃度Tab.3 Serum inflammatory factors and fibrinolytic system concentrations in 5 groups ±s

注：aP ＜0.05，vs.血栓組；bP ＜0.05，vs.低劑量淫羊藿苷組；cP ＜0.05，vs.中劑量淫羊藿苷組

分組假手術組血栓組低劑量淫羊藿苷組中劑量淫羊藿苷組高劑量淫羊藿苷組F 值P 值IL-1β（ng/L）58.01±8.21a 118.29±13.18 102.14±9.43a 88.37±6.81b 71.09±4.97c 11.743 0.003 TNF-α（ng/L）109.24±18.33a 145.93±20.07 136.28±14.24a 124.79±15.26b 113.07±10.62c 9.351 0.001 tPA（μg/L）13.56±3.07a 6.67±1.46 8.99±2.52a 10.37±2.88b 11.79±3.38c 16.672＜0.001 PAI-1（μg/L）35.35±7.23a 96.37±19.13 82.03±11.05a 69.38±9.76b 49.07±8.22c 14.357＜0.001

2.3.3 纖溶系統(tǒng)指標 相較于假手術組，血栓組tPA 濃度顯著降低（P＜0.05），PAI-1 濃度顯著升高（P＜0.05）；相較于血栓組，低劑量淫羊藿苷組tPA濃度顯著升高（P＜0.05），PAI-1 濃度顯著降低（P＜0.05）；相較于低劑量淫羊藿苷組，中劑量淫羊藿苷組tPA 濃度顯著升高（P＜0.05），PAI-1 濃度顯著降低（P＜0.05）；相較于中劑量淫羊藿苷組，高劑量淫羊藿苷組tPA 濃度顯著升高（P＜0.05），PAI-1 濃度顯著降低（P＜0.05）。見表3。

2.4 RT-PCR 檢測 相較于假手術組，模型組NFκB p65、VCAM-1、TF mRNA 表達量顯著增加（P＜0.05）；相較于血栓組，低、中、高劑量淫羊藿苷組NF-κB p65、VCAM-1、TF mRNA 表達量顯著減少（P＜0.05），中劑量淫羊藿苷組NF-κB p65、VCAM-1、TF mRNA表達量少于低劑量淫羊藿苷組（P＜0.05），高劑量淫羊藿苷組NF-κB p65、VCAM-1、TF mRNA表達量少于中劑量淫羊藿苷組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 大鼠靜脈血管NF-κB p65、VCAM-1、TF 的基因表達量Fig.2 Gene expression levels of NF-κB P65，VCAM-1 and TF in rat veins

2.5 Western blot 檢測 相較于假手術組，模型組NF-κB p65、VCAM-1、TF 的蛋白表達量顯著增加（P＜0.05）；相較于血栓組，低、中、高劑量淫羊藿苷組NF-κB p65、VCAM-1、TF 的蛋白表達量顯著減少（P＜0.05），中劑量淫羊藿苷組NF-κB p65、VCAM-1、TF 的蛋白表達量少于低劑量淫羊藿苷組（P＜0.05），高劑量淫羊藿苷組NF-κB p65、VCAM-1、TF 的蛋白表達量少于中劑量淫羊藿苷組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 大鼠靜脈血管NF-κB p65、VCAM-1、TF 的蛋白表達量Fig.3 Protein expression levels of NF-κB p65，VCAM-1 and TF in rat veins

3 討論

作為我國的傳統(tǒng)中藥，淫羊藿具有補肝腎、強筋骨、祛風濕的功效，是補腎壯陽與強陽起瘺方劑的常用中藥，多用于腎陽不足、風濕痹痛與骨瘺的治療［9-11］。而作為淫羊藿中的主要化學成分，淫羊藿苷可用于治療骨質疏松癥、心血管系統(tǒng)疾病、免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等［12-13］。研究證明淫羊藿苷可以阻止不利因素對心肌細胞與血管內皮的損傷。WANG 等［14］過氧化氫誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷為模型，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可抑制內質網(wǎng)中GRP78、ATF4 和eIF2α 蛋白表達減輕氧化應激損傷，發(fā)揮保護血管內皮細胞的作用。HU 等［15］以氧化低密度脂蛋白誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷為模型，發(fā)現(xiàn)淫羊藿可通過調節(jié)Bcl-2 和caspase-3 的蛋白和mRNA 表達水平減少人臍靜脈內皮細胞的凋亡，發(fā)揮血管內皮細胞保護作用。以上結果證實，淫羊藿苷具有血管內皮保護作用。

本實驗采用下腔靜脈狹窄法復制深靜脈血栓模型，在該造模過程中，血栓形成于下腔靜脈遠心端的上游，雖然血栓生長方向與臨床中的患者相反，但是形成的血栓結構與人體血栓類似；另外，該法造模后在不損傷靜脈內皮的情況下可允許少量血流通過，更加貼近人體內血栓區(qū)域靜脈內皮完整的病理狀態(tài)，進一步判斷藥物的治療作用與作用途徑［16］。靜脈狹窄法誘導的深靜脈血栓形成是一個動態(tài)的病理過程，血栓重量是評價其成熟的典型指標。本實驗結果顯示，采用下腔靜脈狹窄法成功復制了深靜脈血栓模型，而淫羊藿苷治療可顯著降低血栓重量，表明淫羊藿苷不但能抑制血栓的形成，還能促進血栓的溶解，3 種劑量下的藥物均可顯著抑制血栓的形成，并且具有劑量依賴性，淫羊藿苷劑量越大抑制效果越明顯。

人體的凝血途徑主要有外源性凝血途徑、內源性凝血途徑及共同途徑，PT 是評估外源性凝血系統(tǒng)狀態(tài)的重要指標，APTT 是評估內源性凝血系統(tǒng)狀態(tài)的重要指標，二者時間的減少提示血液高凝狀態(tài)與血栓性疾?。?7-18］。D-D 是交聯(lián)纖維蛋白水解產(chǎn)物，是一種特異性降解產(chǎn)物，是繼發(fā)性纖溶亢進的標志物［19］，當其濃度升高時說明血漿凝血因子活化與纖維蛋白溶解系統(tǒng)啟動，因此，血漿中檢測D-D 對于血栓性疾病的早期診斷、療效評估和預后判斷具有重要意義。本實驗結果顯示，復制深靜脈血模型后，大鼠血液處于高凝狀態(tài)，全身凝血系統(tǒng)受到較大影響；而淫羊藿苷可改善造模大鼠的血液高凝狀態(tài)，并且具有劑量依賴性，淫羊藿苷劑量越大抑制改善越明顯。韓丹等［20］研究發(fā)現(xiàn)40 mg/kg 的淫羊藿苷可延長深靜脈血栓大鼠血漿的APTT、PT、TT，減少血漿纖維蛋白原濃度，改善血液高凝狀態(tài)，與本實驗結果基本一致。

tPA、PAI-1 是主要由內皮細胞產(chǎn)生的衡量纖溶系統(tǒng)的重要指標，如果二者之間的平衡遭到破壞，將引發(fā)血栓的形成［21-22］。tPA 主要是誘導纖維蛋白降解，PAI-1 是纖溶酶原活化物抑制物，其主要作用是抑制tPA。本實驗結果顯示，淫羊藿苷可通過調節(jié)纖溶系統(tǒng)抑制血栓的形成。

炎癥參與了血栓的形成與發(fā)展。在IL-1β 的刺激下，單核細胞、中性粒細胞黏附于血管內皮，促進內皮細胞合成IL-8 和相關趨化因子，誘導白細胞遷移至炎癥區(qū)域［23-24］；另外，IL-1β 還會促進單核細胞表達TF，促進血栓形成［25］。TNF-α 是由活化的單核細胞、巨噬細胞產(chǎn)生的一種強烈促炎癥因子，其可誘導內皮細胞表達TF，促進血栓形成；其還可促進多種炎性介質的釋放，影響血栓的發(fā)展［26］。本實驗證實其在靜脈血栓模型中同樣發(fā)揮了抗炎作用。

NF-κB 是調控DNA 轉錄、細胞因子分泌和細胞存活的一種蛋白復合物，近年來的相關研究顯示其在靜脈血栓形成中的炎癥機制中扮演著中重要角色，其在內皮細胞、血小板、炎性反應間的相互作用中發(fā)揮調控作用，打破凝血-纖溶的平衡狀態(tài)，因而誘發(fā)血栓的形成［27-28］。LDENG 等［29］研究發(fā)現(xiàn)，血小板激動劑（Pam3CSK4）介導的血小板活化與NF-κB 信號通路有關，血小板激動劑或脂多糖可導致NF-κB IκBα 降解和NF-κB p65 磷酸化，阻斷血小板的活化。在血管內皮細胞中，NF-κB通路激活后分泌出的炎性細胞因子（TNF-α、IL-1等）會損傷內皮細胞，促使其進一步釋放有害的黏附分子、細胞因子、酶類等介質，這些物質又進一步加重內皮細胞的損傷。NARITA 等［30］研究認為作為凝血因子的TF 能夠影響機體凝血功能，其高表達和NF-κB 通路調控密切相關。在多種炎性反應中，NF-κB 信號通路是中心環(huán)節(jié)，該信號通路激活后可提升促炎癥因子的濃度，反過來，炎癥反應又通過該通路促進內皮細胞表達單核細胞趨化蛋白-1、血小板內皮細胞黏附分子、VCAM-1 等黏附分子和細胞因子，進一步激活NF-κB 信號通路，如此反復，促進炎癥的級聯(lián)反應，激活血小板聚集和凝血反應，形成高凝狀態(tài)。本實驗結果顯示，NFκB 信號通路被激活；淫羊藿苷可抑制F-κB 信號通路的激活，降低血管內皮損傷。

本實驗顯示，在10 ～40 mg/kg 的劑量范圍內，淫羊藿苷可通過調節(jié)凝血功能、纖溶系統(tǒng)、炎癥反應來抑制靜脈血栓的形成，并且該作用可能與調節(jié)控NF-κB p65 信號通路有關。但是，本實驗還存在很多不足之處，例如：關于淫羊藿苷的最佳作用劑量還有待進一步的驗證，接下來的實驗應進一步增加藥物作用劑量；實驗周期僅設置了一個觀察時間點，未進行動態(tài)觀察，未來將增加時間點，進一步觀察各指標的動態(tài)變化。