楊志偉，耿亞松，李國臻，陶林林，戴豪楊，戴芳芳，鄭波

(邢臺(tái)不孕不育專科醫(yī)院/邢臺(tái)生殖與遺傳?？漆t(yī)院，邢臺(tái) 054000)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)中通過促排卵得到較多的卵母細(xì)胞，體外培養(yǎng)后可挑選形態(tài)學(xué)較好的胚胎移植入子宮，提高單次移植成功率，但卵母細(xì)胞利用率較低，通常需要獲得10枚卵母細(xì)胞才能獲得滿意的妊娠結(jié)局[1]。大量研究表明，體外過夜受精時(shí)非生理狀態(tài)的高濃度精子產(chǎn)生氧自由基等損傷胚胎發(fā)育潛能[2-3]，短時(shí)受精聯(lián)合早期補(bǔ)救ICSI可有效避免卵母細(xì)胞受精失敗的風(fēng)險(xiǎn)，并且短時(shí)受精比過夜受精可獲得更好的胚胎結(jié)局和臨床妊娠結(jié)局[4-5]。因此，短時(shí)受精已被廣泛應(yīng)用于國內(nèi)大量生殖醫(yī)學(xué)中心。

中國專家共識(shí)[6]建議短時(shí)受精加精時(shí)間為HCG注射后38～40 h，受精率較為理想。HCG注射后授精時(shí)機(jī)可能會(huì)影響卵母細(xì)胞的發(fā)育能力[7]。增加受精前卵母細(xì)胞孵育時(shí)間有利于卵母細(xì)胞質(zhì)成熟，核質(zhì)同步成熟是卵子受精和獲得優(yōu)質(zhì)胚胎的有力保障，但卵母細(xì)胞體外孵育時(shí)間過長可引起卵母細(xì)胞的老化，且培養(yǎng)基中代謝廢物的積累均可導(dǎo)致非整倍體概率的增加[8]，錯(cuò)過最佳受精時(shí)機(jī)。短時(shí)受精縮短精卵共培養(yǎng)時(shí)間至1～6 h，能夠改善可移植胚胎率和優(yōu)質(zhì)胚胎率[9]。在規(guī)范的時(shí)間內(nèi)，適當(dāng)調(diào)整授精時(shí)機(jī)可導(dǎo)致卵母細(xì)胞孵育時(shí)間和精卵共孵育時(shí)間長短的改變。本研究分析卵母細(xì)胞取出后體外孵育時(shí)間和精卵共孵育時(shí)間對IVF-ET結(jié)局的影響，探討在取卵時(shí)間和脫顆粒細(xì)胞時(shí)間相對固定的情況下，如何綜合考慮取卵后卵母細(xì)胞孵育時(shí)間和精卵共孵育時(shí)間，選擇合適的授精方案。

材料與方法

一、研究對象

回顧性分析2017年1月至2020年12月在我院生殖中心行IVF-ET治療患者的臨床數(shù)據(jù)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：女方年齡≤35 歲；首次主因女方輸卵管因素接受輔助生殖短時(shí)受精助孕，新鮮胚胎移植；排除子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔炎等宮腔和盆腔病變，子宮畸形和染色體異?；颊摺?/p>

所研究的時(shí)間段共2 060例患者在我中心行短時(shí)受精助孕。排除短時(shí)受精失敗行早期補(bǔ)救ICSI 119例和未新鮮周期移植748例，最終共1 193例行短時(shí)受精新鮮周期移植的患者納入分析。

二、診療回顧

1.控制性促排卵：納入研究對象均采用常規(guī)長方案促排卵，女方在黃體期肌肉注射促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a，達(dá)菲林，益普生，法國)，達(dá)到降調(diào)節(jié)后，給予重組促卵泡β素(rFSH，普利康，歐加農(nóng)，荷蘭)或尿促性素(HMG，樂寶得，珠海麗珠制藥)促排卵，定期通過陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，當(dāng)1/3卵泡直徑≥18 mm時(shí)肌肉注射HCG(珠海麗珠制藥)5 000～10 000 U，36 h左右B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。卵冠丘復(fù)合體置于37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.體外受精和胚胎移植：HCG注射后38～40 h授精。30～50 μl微滴法授精，每滴1～2個(gè)卵母細(xì)胞，授精濃度為2×105條/ml。授精后1～6 h拆除卵子周圍大量顆粒細(xì)胞，觀察受精情況酌情行早補(bǔ)救ICSI。授精后16～18 h觀察，出現(xiàn)兩個(gè)極體和兩個(gè)原核為正常受精，兩個(gè)以上原核為多原核受精。參考2011年版ESHERE發(fā)布的Istanbul共識(shí)[10]，受精后第3天根據(jù)卵裂球數(shù)目、大小不均、碎片和有無多核等情況判定胚胎質(zhì)量為優(yōu)質(zhì)、中等和差，選擇中等及以上1～2枚胚胎進(jìn)行移植和冷凍，剩余胚胎培養(yǎng)囊胚；受精后第5天和第6天對囊胚進(jìn)行評(píng)分，參考Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[11]，選擇3BC及以上評(píng)分囊胚移植或冷凍。

3.黃體支持和妊娠確定：取卵當(dāng)日肌注黃體酮注射液(浙江仙琚)進(jìn)行黃體支持。視HCG注射日E2水平，移植日給予適量雌二醇(補(bǔ)佳樂，拜耳醫(yī)藥，德國)補(bǔ)充，移植當(dāng)日常規(guī)使用黃體酮(安琪坦，博賞醫(yī)藥，法國)口服或陰道上藥進(jìn)行黃體支持。移植后14 d查血HCG，陽性者移植后28 d行B超檢查，見孕囊確定臨床妊娠。

三、分組及觀察指標(biāo)

根據(jù)注射HCG日雌激素水平的中位數(shù)將新鮮周期移植患者二分類為E2≤11 129.63 pmol/L組(A組)和E2>11 129.63 pmol/L組(B組)；再根據(jù)取卵至授精時(shí)長的中位數(shù)將新鮮周期移植患者二分類為卵母細(xì)胞孵育時(shí)間≤3 h組(A1組和B1組)和卵母細(xì)胞孵育時(shí)間>3 h組(A2組和B2組)。

卵母細(xì)胞孵育時(shí)間為取卵至授精時(shí)間，精卵共孵育時(shí)間為授精至脫顆粒細(xì)胞時(shí)間；正常受精率=受精后16～18 h出現(xiàn)2原核及2極體卵子數(shù)/加精卵子總數(shù)×100%；多PN率≥3原核卵子數(shù)/加精卵子總數(shù)×100%；可移植胚胎率=(冷凍或移植評(píng)級(jí)為中等及以上的卵裂胚數(shù)+3BC及以上囊胚數(shù))/卵裂數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=(冷凍或移植優(yōu)質(zhì)卵裂胚數(shù)+3BB及以上囊胚數(shù))/卵裂數(shù)×100%；早補(bǔ)救ICSI率=早補(bǔ)救ICSI周期數(shù)/短時(shí)受精周期數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/新鮮移植周期數(shù)×100%；種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者基礎(chǔ)資料比較

共1 193例短時(shí)受精且完成鮮胚移植的患者納入最終分析。依據(jù)HCG日雌激素水平將新鮮周期移植患者分為E2≤11 129.63 pmol/L組(A組，n=596)和E2>11 129.63 pmol/L組(B組，n=597)；再依據(jù)取卵至授精時(shí)間細(xì)分為卵母細(xì)胞孵育時(shí)間≤3 h組(A1組和B1組)和卵母細(xì)胞孵育時(shí)間>3 h組(A2組和B2組)兩個(gè)亞組。因而總共分為A1(n=277)、A2(n=319)、B1(n=320)、B2(n=277)4個(gè)組進(jìn)行分析。

4組患者間女方年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH水平和HCG日子宮內(nèi)膜厚度均無顯著性差異(P>0.05)；A1、A2兩組HCG日E2和孕酮(P)水平顯著低于B1、B2組(P<0.05)，但A、B組內(nèi)亞組間比較無顯著差異(P>0.05)(表1)。

二、患者體外受精/新鮮胚胎移植結(jié)局比較

1.受精及胚胎培養(yǎng)結(jié)局：A組(A1、A2)獲卵數(shù)顯著低于B組(B1、B2)(P<0.05)，可移植胚胎率顯著高于B組(B1、B2)(P<0.05)，而同組亞組間(A1 vs. A2，B1 vs. B2)比較均無顯著差異(P>0.05)。4組患者間正常受精率、多PN受精率和囊胚形成率均無顯著差異(P>0.05)。A1、B1組較A2、B2組精卵共孵育時(shí)間顯著延長(P<0.05)；B2組優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于B1組(P<0.05)，A2組優(yōu)質(zhì)胚胎率較A1組有增高趨勢(25.85% vs. 23.99%)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表1 患者基礎(chǔ)資料比較(-±s)

表2 患者體外受精及胚胎培養(yǎng)結(jié)局比較[(-±s)，%]

2.新鮮胚胎移植周期結(jié)局：4組間移植胚胎數(shù)、囊胚占比、臨床妊娠率和流產(chǎn)率均無顯著差異(P>0.05)；A1組胚胎種植率顯著低于其他3組(P<0.05)，A2組臨床妊娠率相對于A1組有增高趨勢但無顯著差異(63.32% vs. 57.40%，P>0.05)；B1與B2組間臨床妊娠率和種植均無顯著差異(P>0.05)(表3)。

表3 患者新鮮胚胎移植周期結(jié)局比較[(-±s)，%]

三、卵母細(xì)胞孵育時(shí)間和精卵共孵育時(shí)間與短時(shí)受精胚胎結(jié)局的相關(guān)性

采用Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：隨著卵母細(xì)胞孵育時(shí)間的增加，精卵共孵育時(shí)間顯著縮短(R=-0.318，P<0.001)；卵母細(xì)胞孵育時(shí)間和精卵共孵育時(shí)間與正常受精率、囊胚形成率和可移植胚胎率無顯著相關(guān)性(P>0.05)；卵母細(xì)胞孵育時(shí)間與多PN率呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.006，P=0.008)；精卵共孵育時(shí)間與優(yōu)質(zhì)胚胎率呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.057，P=0.012)(表4)。

四、卵母細(xì)胞孵育時(shí)間和精卵共孵育時(shí)間對短時(shí)受精臨床結(jié)局的影響

采用二元Logistics回歸排除了女方年齡、BMI、子宮內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、移植囊胚占比和胚胎移植個(gè)數(shù)的影響。結(jié)果顯示，2 060例患者行短時(shí)受精助孕，其中短時(shí)受精失敗行早期補(bǔ)救ICSI 119例，卵母細(xì)胞孵育時(shí)間和精卵共孵育時(shí)間對于短時(shí)受精是否失敗均非獨(dú)立影響因素(P>0.05)；1 193例行短時(shí)受精新鮮周期移植的患者中，卵母細(xì)胞孵育時(shí)間與精卵共孵育時(shí)間對新鮮周期移植的臨床妊娠率、種植率和流產(chǎn)率均非獨(dú)立影響因素(P>0.05)(表5)。

表4 卵母細(xì)胞孵育時(shí)間、精卵共孵育時(shí)間與短時(shí)受精胚胎結(jié)局的相關(guān)性分析

表5 卵母細(xì)胞孵育時(shí)間、精卵共孵育時(shí)間對短時(shí)受精臨床結(jié)局的二分類Logistic回歸分析

討 論

體外受精通常采用長受精，精卵共孵育18～20 h，但發(fā)生完全不受精比例為4%～16%[12]，而在不明原因不孕的患者中，這一比例甚至高達(dá)25%[13]。短時(shí)受精縮短精卵共孵育時(shí)間為1～6 h，聯(lián)合補(bǔ)救ICSI成為預(yù)防完全受精失敗和受精率低的有效方法[14]。很多研究表明短時(shí)受精可提高卵母細(xì)胞利用率和胚胎種植率，人類自然生理?xiàng)l件不會(huì)出現(xiàn)高濃度精子與卵母細(xì)胞共同孵育情況，短時(shí)受精縮短了高濃度精子對卵母細(xì)胞作用，更接近生理狀態(tài)。因此，短時(shí)受精已被廣泛應(yīng)用于體外受精-胚胎移植技術(shù)中[3-4]。

受精前卵母細(xì)胞孵育時(shí)間對IVF-ET結(jié)局的影響存在爭義，增加受精前卵母細(xì)胞孵育時(shí)間有利于卵母細(xì)胞質(zhì)成熟，核質(zhì)同步成熟是卵子受精和優(yōu)質(zhì)胚胎獲得的有力保障。蔡慧中等[15]發(fā)現(xiàn)在注射HCG后38～42 h范圍內(nèi)授精，授精時(shí)機(jī)在41～42 h時(shí)優(yōu)質(zhì)胚胎率和可利用胚胎率最高，并且可獲得較好的臨床妊娠率，但卵母細(xì)胞體外孵育時(shí)間過長可引起卵母細(xì)胞的老化，且培養(yǎng)基中代謝廢物的積累均可導(dǎo)致非整倍體概率的增加[16-17]，錯(cuò)過最佳受精時(shí)機(jī)。本研究顯示注射HCG后38～40 h授精，隨著卵母細(xì)胞孵育時(shí)間的增加，多原核受精明顯降低，但正常受精率、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率和可移植胚胎率沒有顯著變化。卵母細(xì)胞孵育時(shí)間3～4 h和精卵共孵育時(shí)間1～6 h的條件下，授精時(shí)機(jī)不影響短時(shí)受精失敗，同時(shí)對臨床妊娠率、種植率和流產(chǎn)率也沒有明顯的影響。

然而調(diào)整授精前后孵育時(shí)間可能改善特定人群助孕結(jié)局。近年有研究報(bào)道適當(dāng)延長卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間[HCG注射后(41±1)h授精]是高齡卵巢低反應(yīng)患者獲得優(yōu)質(zhì)胚胎的一種簡單有效的方法[18]，Le Bras等[19]就證實(shí)縮短精卵共孵育時(shí)間可以改善胚胎碎片多患者的胚胎質(zhì)量?？紤]到雌激素水平可能是反映卵母細(xì)胞成熟度的有效指標(biāo)[20]，本研究根據(jù)HCG注射日雌激素水平的中位數(shù)將新鮮周期移植患者二分類為低E2組(E2≤11 129.63 pmol/L，A組)和高E2組(E2>11 129.63 pmol/L，B組)，再根據(jù)取卵至授精時(shí)長分為短卵母細(xì)胞孵育時(shí)間組(≤3 h，A1組和B1組)和長時(shí)間卵母細(xì)胞孵育時(shí)間組(>3 h，A2組和B2組)，探討扳機(jī)日不同血清雌激素水平時(shí)授精前后孵育時(shí)間對IVF-ET妊娠結(jié)局的影響。A組獲卵數(shù)、HCG日E2和P水平顯著低于B組，但A、B組內(nèi)亞組間比較無顯著差異(P>0.05)，因此，A1與A2以及B1與B2的胚胎結(jié)局和妊娠結(jié)局有一定的可比性。B2組優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于B1組(P<0.05)，A2組優(yōu)質(zhì)胚胎率較A1組有增高趨勢，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HCG日E2水平較低時(shí)A2組的種植率顯著高于A1組(P<0.05)；HCG日E2水平較高時(shí)B1和B2兩組種植率沒有顯著差異。因此，注射HCG日E2水平較低時(shí)增加卵母細(xì)胞孵育時(shí)間降低精卵共孵育時(shí)間，可能獲得較好的IVF-ET結(jié)局。

減少了精卵共孵育時(shí)間是否影響卵母細(xì)胞受精率是胚胎技術(shù)人員最關(guān)心的問題，多數(shù)研究表明縮短精卵共孵育時(shí)間并不影響受精率。中國專家共識(shí)建議短時(shí)受精加精時(shí)間為HCG注射后38～40 h，精卵共孵育時(shí)間1～6 h受精率和胚胎結(jié)局較為理想[6]。本研究納入病例的受精時(shí)間和精卵共孵育時(shí)間均在專家共識(shí)建議范圍內(nèi)。取卵時(shí)間和脫顆粒細(xì)胞時(shí)間相對固定的情況下，授精時(shí)機(jī)影響取卵后卵母細(xì)胞孵育時(shí)間和精卵共孵育時(shí)間。本研究顯示隨著卵母細(xì)胞孵育時(shí)間的延長，精卵共孵育時(shí)間(R=-0.318，P=0.000)顯著縮短。理想條件下，哺乳動(dòng)物性交后20 min內(nèi)可使卵母細(xì)胞受精[21]，熒光標(biāo)記的精子與正常卵冠丘復(fù)合體共孵育15 min進(jìn)入卵丘，3 h內(nèi)穿過卵丘層，4 h出現(xiàn)在卵母細(xì)胞皮層，且精卵共孵育時(shí)間16 h比1 h多精受精率高，這表明縮短精卵共孵育時(shí)間到1 h不影響卵母細(xì)胞受精[22]。這與我們的研究結(jié)果相似，在1～6 h內(nèi)，精卵共孵育時(shí)間與短時(shí)受精失敗沒有顯著相關(guān)性，但男方精液質(zhì)量、加精濃度和操作流程均可能影響受精率，不同生殖中心可能有不一樣的結(jié)果。早期大量研究表明短時(shí)受精縮短了高濃度精子對卵母細(xì)胞作用，更接近生理狀態(tài)。常規(guī)體外受精時(shí)較短時(shí)受精時(shí)具有較高濃度的活性氧(reactive oxygen species，ROS)[23]，顆粒細(xì)胞持續(xù)分泌E2及 P[24]，高水平E2對胚胎有毒性作用，縮短精卵共孵育時(shí)間可降低ROS，較早去除大量顆粒細(xì)胞可以降低ROS和E2等對胚胎的不利因素。在短時(shí)受精中精卵共孵育時(shí)間是否對胚胎發(fā)育潛能有影響，目前沒有報(bào)道。我們的數(shù)據(jù)顯示，精卵共孵育時(shí)間1～6 h范圍內(nèi)，隨著精卵共孵育時(shí)間增加優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著降低(R=-0.057，P=0.012)。短時(shí)受精中降低精卵共孵育時(shí)間可能通過降低大量精子產(chǎn)生的ROS對胚胎發(fā)育潛能的負(fù)面影響，提高優(yōu)質(zhì)胚胎率。這可能是本研究中HCG日E2水平較低時(shí)A2組胚胎種植率顯著高于A1組的原因，而HCG日高E2組具有較高的獲卵數(shù)，新鮮周期可以獲得較多優(yōu)質(zhì)胚胎用于移植，B1和B2組的首次移植周期胚胎種植率沒有顯著差異。

綜上所述，隨著卵母細(xì)胞孵育時(shí)間的延長，精卵共孵育時(shí)間顯著縮短；卵母細(xì)胞孵育時(shí)間3～4 h和精卵共孵育時(shí)間1～6 h的條件下，隨著卵母細(xì)胞孵育時(shí)間的增加多原核受精率降低，精卵共孵育時(shí)間的增加不利于優(yōu)質(zhì)胚胎的形成；授精前后孵育時(shí)間非影響短時(shí)受精失敗、臨床妊娠率、種植率和流產(chǎn)率的獨(dú)立影響因素。但若注射HCG日E2水平≤11 129.63 pmol/L，建議增加卵母細(xì)胞孵育時(shí)間降低精卵共孵育時(shí)間，可能獲得較好的胚胎種植率。調(diào)整授精時(shí)機(jī)，適當(dāng)延長卵母細(xì)胞孵育時(shí)間降低精卵共孵育時(shí)間的策略是否能夠改善IVT-ET的結(jié)局有待進(jìn)一步前瞻性隨機(jī)對照研究，期望為IVF-ET精細(xì)化治療提供參考。