李爽，崔金全，郭婷婷，歸婧，謝林森，楊小風(fēng)

(1.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450000)

抗磷脂綜合征(anti-phospholipid syndrome，APS)是一種由多種抗磷脂抗體(anti-phospholipid antibody，aPL)介導(dǎo)的非炎癥、多系統(tǒng)受累的免疫性疾病[1]，其特征為存在aPL，例如抗心磷脂抗體(anti-cardiolipin antibody，aCL)、抗β2-糖蛋白1抗體(anti-β2-glycoprotein 1 antibody，aβ2GP1)和狼瘡抗凝物(lupus anticoagulant，LA)。APS有多種臨床表型，復(fù)雜多變，包括動(dòng)靜脈血栓的形成以及產(chǎn)科并發(fā)癥(無法解釋的反復(fù)發(fā)作的早期流產(chǎn)、先兆子癇、早產(chǎn)等)[2]等。參考2010年修訂的札幌標(biāo)準(zhǔn)，至少同時(shí)滿足1條臨床標(biāo)準(zhǔn)及1條實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)才可明確診斷APS[3]。實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)主要評(píng)估的是aPL滴度，aPL持續(xù)性中高滴度是APS重要的血清學(xué)標(biāo)志。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)aPL與多種分類標(biāo)準(zhǔn)外的臨床表現(xiàn)有密切關(guān)聯(lián)，并且酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)作為標(biāo)準(zhǔn)推薦的aPL的檢測方法，存在標(biāo)準(zhǔn)化缺乏、實(shí)驗(yàn)操作影響因素較多、實(shí)驗(yàn)室間檢測結(jié)果變異系數(shù)大等缺陷，因此實(shí)驗(yàn)室選用重復(fù)性高、建立由本地健康志愿者及檢測儀器、試劑得到的內(nèi)部臨界值對(duì)于臨床精準(zhǔn)診斷、降低誤診漏診率至關(guān)重要。本研究可使aPL的檢測更具有特色和地域化，而非單獨(dú)參考商品試劑提供的參考閾值，為臨床特異性診斷該疾病、提升臨床診治能力提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料隨機(jī)選取2020年1—12月于鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院體檢中心進(jìn)行體檢的150名至少已正常分娩過1次的20～40歲志愿者為研究對(duì)象。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在妊娠并發(fā)癥、腫瘤、血栓、自身免疫病、不良孕產(chǎn)史、感染等。最終入組120例健康受試者。志愿者均簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 儀器與材料選取鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院檢驗(yàn)科所用的6種商用試劑(INOVA檢測試劑盒)，分別是aCL和aβ2GP1的IgA、IgG、IgM亞型，使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行檢測。

1.3 檢測原理本試驗(yàn)采用化學(xué)發(fā)光的2步免疫方法。(1)試劑包含包被心磷脂的磁性顆粒，可以捕獲樣品中aCL。經(jīng)過孵育、磁性分離和清洗后，加入包含異魯米諾標(biāo)記的抗人IgA、IgG、IgM抗體示蹤劑，可以結(jié)合顆粒上捕獲的抗心磷脂IgA、IgG、IgM抗體。再次經(jīng)過孵育、磁性分離和清洗后，加入激發(fā)劑，采用全自動(dòng)免疫分析儀光學(xué)系統(tǒng)以相對(duì)光單位(relative light unit，RLU)測定該反應(yīng)所發(fā)的光。RLUs的值與樣品中抗心磷脂IgA、IgG、IgM抗體水平成正比。(2)試劑包含包純化的人抗β2-糖蛋白1的磁性顆粒，可以捕獲樣品中aβ2GP1。經(jīng)過孵育、磁性分離和清洗步驟后，加入包含異魯米諾標(biāo)記的抗人IgA、IgG、IgM抗體示蹤劑，可以結(jié)合顆粒上捕獲的抗β2-糖蛋白1的IgA、IgG、IgM抗體。再次經(jīng)過孵育、磁性分離和清洗步驟后，加入激發(fā)劑，采用全自動(dòng)免疫分析儀光學(xué)系統(tǒng)以RLU測定該反應(yīng)所發(fā)的光。RLUs的值與樣品中抗β2-糖蛋白1的IgA、IgG、IgM抗體水平成正比。

1.4 檢測方法取受試者血液5 mL置于無抗凝劑紅管中，垂直靜置1 h后以3 500 r·min-1離心8 min，檢測前由檢驗(yàn)科專業(yè)醫(yī)生對(duì)全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行校準(zhǔn)及質(zhì)控，合格后使用儀器按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程檢測血清aCL和aβ2GP1水平。測量單位為CU。1 CU對(duì)應(yīng)的是16.3 μg·L-1的嵌合參考抗體。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。分別計(jì)算aCL和aβ2GP1的IgA、IgG、IgM的第50百分位數(shù)、第95百分位數(shù)以及第99百分位數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 一般資料120例健康受試者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)及籍貫見表1。

表1 健康受試者的一般資料

2.2 aCL及aβ2GP1各型別結(jié)果aCL的IgA、IgG、IgM的第99百分位數(shù)分別是3.9、20.0、11.0 CU，其中IgA和IgM與廠家截?cái)嘀涤休^大差別，IgG與參考值相同。aβ2GP1的IgA、IgG、IgM的第95百分位數(shù)分別是4.0、10.6、35.5 CU，與廠家截?cái)嘀稻忻黠@差別，其中最明顯的是IgA，其次是IgM。見表2。

表2 aCL和aβ2GP1的IgA、IgG、IgM的各型別結(jié)果及廠家截?cái)嘀?CU

3 討論

APS是一種獲得性自身免疫性血栓形成性疾病，研究表明該病主要發(fā)生在育齡期婦女中，大于50歲的女性發(fā)病率僅為12%[4]。APS可分為原發(fā)性APS、繼發(fā)性APS和災(zāi)難性APS，其臨床表現(xiàn)多樣且復(fù)雜多變，非孕期的APS患者存在血小板減少、血栓形成、溶血性貧血、心臟瓣膜病變等表現(xiàn)，妊娠合并APS的患者多表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、胎兒生長受限、嚴(yán)重子癇前期、早產(chǎn)等，此類患者又被稱為產(chǎn)科抗磷脂綜合征(obstetric antiphospholipid syndrome，OAPS)[5-6]。有研究表明，aPL持續(xù)陽性的女性發(fā)生不良妊娠的概率是正常人群的2～3倍[7]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中aPL的陽性率可達(dá)5%～20%[8]。研究表明中高滴度的aCL水平與孕婦子癇前期的發(fā)生呈正相關(guān)[9]。因此明確診斷APS，提高診斷敏感性，從而進(jìn)行有效的治療對(duì)改善患者妊娠結(jié)局十分必要。

APS的診斷依賴于患者的臨床癥狀及標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室檢查。札幌標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定診斷APS需要至少1項(xiàng)臨床癥狀和至少1項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室陽性指標(biāo)[3](LA陽性；中、高滴度的IgG、IgM型aCL；IgG、IgM型aβ2GP1陽性。以上至少檢測到2次，且每次間隔超過12周)。LA檢測過程較為煩瑣，且對(duì)于標(biāo)本的要求較高，現(xiàn)已較少使用。臨床較為常用的為aCL及aβ2GP1。aPL是一組異質(zhì)性較大的自身抗體，在經(jīng)典APS及非標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)科APS患者中存在差異，且在系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫病、惡性腫瘤、感染性疾病甚至部分正常人中也可出現(xiàn)低滴度陽性。有研究表明低滴度的aPL陽性率在一般人群中為1%～5%；在無不良妊娠史的育齡期婦女中約為2%，有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史的女性中可達(dá)到15%[10]。所以使用重復(fù)性佳的檢測方法建立屬于本地實(shí)驗(yàn)室的截?cái)嘀祵?duì)避免漏診誤診存在重要意義。

目前，實(shí)驗(yàn)室多采用ELISA檢測aCL和aβ2GP1水平。標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)化操作缺乏共識(shí)導(dǎo)致檢測程序標(biāo)準(zhǔn)化較差，實(shí)驗(yàn)室間和分析間存在高度差異[11]?，F(xiàn)在已有新的方法用于檢測aPL水平?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)目前可用于aPL水平檢測。有研究表明CLIA檢測aCL及aβ2GP1的靈敏度及特異性比ELISA高，實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)快速簡單，并且高度自動(dòng)化，可減少實(shí)驗(yàn)室間變異[12-15]。本研究中所使用的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀已證實(shí)與ELISA的診斷性能相當(dāng)[16]?，F(xiàn)在CLIA已逐步應(yīng)用于國內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室。

為了驗(yàn)證廠商提供的截?cái)嘀凳欠襁m用于本地，本研究選取了120名健康且至少已正常生產(chǎn)過1次的女性，采用CLIA方法檢測aCL及aβ2GP1的3種亞型，并計(jì)算其第99百分位數(shù)，可以看出aCL的IgG亞型與廠家截?cái)嘀祷疽恢?，但I(xiàn)gA與IgM低于廠家截?cái)嘀?，而aβ2GP1的IgM高于廠商截?cái)嘀担琁gG與IgA均低于廠家截?cái)嘀?。這表明廠家截?cái)嘀挡⒉煌耆m用于本地。按照此次研究得出的截?cái)嘀?，部分曾無法得到確診的血清學(xué)陰性但臨床表現(xiàn)符合APS的患者便可診斷，得到標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)的規(guī)范化治療，極大提高了疾病診斷率，減少臨床漏診誤診，從而為規(guī)范化診療提供一定的參考。

目前臨床診斷APS時(shí)，多發(fā)現(xiàn)aCL和aβ2GP1的IgG及IgM滴度增高，IgA陽性較少見。但I(xiàn)gA型aCL和aβ2GP1是aPL的重要組成部分，既往已有研究表明其與不良妊娠及血栓形成有關(guān)[17]。第13屆國際抗磷脂抗體大會(huì)的共識(shí)表明，檢測aCL和aβ2GP1時(shí)，優(yōu)先推薦IgM與IgG亞型，當(dāng)兩者均陰性時(shí)檢測IgA亞型[3]。目前支持aCL及aβ2GP1的IgA亞型作為APS的診斷標(biāo)志物的證據(jù)主要為回顧性研究數(shù)據(jù)，且存在一定局限性，如研究人群的異質(zhì)性、研究設(shè)計(jì)、使用的檢測方法以及陽性臨界值等的確定仍存有爭議[18]。有研究表明，盡管所有抗體同種型均對(duì)APS具有特異性，但aβ2GP1的IgA亞型對(duì)APS的特異性優(yōu)于aβ2GP1的IgM亞型[19]。另有多中心研究(納入5 892例患者)表明，aβ2GP1的IgA亞型陽性與動(dòng)靜脈血栓以及多種血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[20]。最近1項(xiàng)針對(duì)新型冠狀病毒肺炎患者的研究顯示，3例腦梗死患者血清中aCL及aβ2GP1的IgA亞型均呈高滴度陽性[21]。本研究結(jié)果顯示，aCL及aβ2GP1的IgA亞型水平較低，重新定義其截?cái)嘀祷蛟S對(duì)明確診斷APS患者有深遠(yuǎn)意義。

本研究中除aCL的IgG亞型與廠商提供的參考區(qū)間基本一致，其余5項(xiàng)指標(biāo)與其相差較大，可能存在以下原因：檢測標(biāo)本數(shù)量較少，實(shí)驗(yàn)過程存在誤差，部分入組志愿者隱瞞健康狀況，人群的異質(zhì)性等。應(yīng)擴(kuò)大志愿者人群，減少誤差，得到更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。臨床上表現(xiàn)為APS但aCL及aβ2GP1未達(dá)到陽性標(biāo)準(zhǔn)的患者較多，若排除以上因素，是否存在更加具有特異性的指標(biāo)用于診斷APS值得思考，如抗磷脂酰絲氨酸/抗凝血酶原抗體(anti-phosphatidylserine/prothrombin，aPS/PT)、抗磷脂酰乙醇胺抗體(anti-phosphatidylethanolamine antibodies，aPE)等，已有研究表明這些非標(biāo)準(zhǔn)aPL與血栓形成、產(chǎn)科并發(fā)癥有較強(qiáng)的相關(guān)性[22-23]。有研究顯示，同時(shí)檢測aPS/PT有助于APS的診斷[24]?？鼓委煵桓蓴_aPS/PT的檢測，此項(xiàng)指標(biāo)很有可能成為LA的替代指標(biāo)。目前aPS/PT已被納入APS評(píng)分體系中，用于評(píng)估個(gè)體APS相關(guān)血栓風(fēng)險(xiǎn)。

隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，aPL的檢測方法將更加規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化。在此之前，應(yīng)根據(jù)各地區(qū)受眾人群、檢測方法等的不同建立符合當(dāng)?shù)靥攸c(diǎn)的參考范圍，從而更加準(zhǔn)確地診斷APS患者，為提升臨床診治能力提供一定的參考。