王建 范江偉 陳洪濤

0 引言

感染性骨缺損主要是由于早期不恰當(dāng)?shù)那鍎?chuàng)或固定導(dǎo)致傷口裂開，繼而引發(fā)感染形成的并發(fā)癥[1]。傳統(tǒng)的治療途徑包括植骨、Ilizarov 技術(shù)、Masquelet誘導(dǎo)膜技術(shù)及抗生素治療等，雖然有一定的修復(fù)效果，但仍難以滿足臨床治療。目前最大的難點(diǎn)是缺少一種既具備抗感染能力又能填補(bǔ)骨缺損的骨組織替代材料[2]。隨著數(shù)字醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，3D打印骨組織工程支架負(fù)載局部藥物緩釋系統(tǒng)為治療感染性骨缺損提供了一種新的途徑[3]。

磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)主要是由鈣、磷組成，其成分與骨基質(zhì)的無機(jī)成分相似，根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)的不同可分為高溫型α-TCP 和低溫型β-TCP[4]。β-TCP具有良好的生物活性和降解性，動(dòng)物或人體細(xì)胞可以在β-TCP材料上正常生長(zhǎng)、分化和繁殖，是理想的人體硬組織替代材料[5]。萬古霉素(vancomycin，VAN)是糖肽類窄譜抗生素，主要通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵組分肽聚糖來干擾細(xì)胞壁的合成，抑制細(xì)胞壁中磷脂和多肽的生成，也可能改變細(xì)菌細(xì)胞膜的滲透性，對(duì)葡萄球菌屬中甲氧西林敏感及耐藥株有良好的抗菌作用[6-7]。因此將VAN包埋于緩釋載體制成緩釋微球后進(jìn)行局部給藥，不僅能發(fā)揮其抗菌作用，而且還能避免許多不良反應(yīng)。對(duì)于緩釋載體的研究，近年來已經(jīng)有大量的天然或人造材料被廣泛應(yīng)用于緩釋微球的制備，天然材料如藻酸鹽、膠原、纖維素和明膠，人造材料如聚乳酸、聚乙醇酸及兩者的共聚物聚乳酸-羥基乙酸(poly lactic co glycolic acid，PLGA)[8]。PLGA的降解產(chǎn)物是乳酸和羥基乙酸，同時(shí)也是人代謝途徑的副產(chǎn)物，所以當(dāng)它應(yīng)用在醫(yī)藥和生物材料中時(shí)不會(huì)有毒副作用，可以用來充當(dāng)藥物緩釋載體[9]。目前，PLGA作為藥物緩釋載體的制備方法有乳化溶劑揮發(fā)法、噴霧干燥法、膜乳化法以及微流體法，乳化溶劑揮發(fā)法因簡(jiǎn)易的操作流程和相對(duì)精簡(jiǎn)的儀器設(shè)備成為制備微球最常用的方法[10]。

基于此，本研究通過 3D 打印工藝，以β-TCP為基礎(chǔ)材料，構(gòu)建立體網(wǎng)格狀支架。以復(fù)乳法制備VAN/PLGA 緩釋微球，并用殼聚糖包被靜電吸附法將緩釋微球負(fù)載于3D 打印多孔β-TCP支架，構(gòu)建既有骨修復(fù)作用又有抗菌作用的復(fù)合支架，并對(duì)支架進(jìn)行表征評(píng)價(jià)，觀察其緩釋性能、力學(xué)性能和抗感染修復(fù)功能，初步評(píng)價(jià)其作為修復(fù)骨缺損材料的可行性，以期為感染性骨缺損的治療尋找一種全新的治療方法。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

PLGA(購自Sigma公司)；VAN(購自浙江醫(yī)藥股份有限公司)；β-TCP(購自上海鼓臣生物技術(shù)有限公司)；殼聚糖、聚乙烯醇(均購自北京有機(jī)化學(xué)廠)；二氯甲烷(購自西安化學(xué)試劑廠)；3D噴墨打印機(jī)(購自德國(guó)Envision TEC公司)；掃描電鏡(購自日本Jeol公司)；紫外分光光度儀(購自美國(guó)HP公司)；醫(yī)用離心機(jī)(購自北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 3D打印多孔β-TCP負(fù)載VAN/PLGA緩釋微球復(fù)合支架的構(gòu)建

(1) 3D打印多孔β-TCP支架：利用CAD軟件繪制多孔β-TCP支架，將β-TCP粉與6% PVA黏結(jié)劑按5∶3的比例混合為打印墨水，用3D打印機(jī)打印，打印完畢后在室溫下干燥，并在馬弗爐中燒結(jié)成質(zhì)地堅(jiān)硬的β-TCP骨組織工程支架。

(2) VAN/PLGA緩釋微球制備：采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法(W/O/W)制備緩釋微球，將0.3 g/mL的VAN水溶液與44.5 mg/L的PLGA二氯甲烷溶液按1∶9混合后進(jìn)行超聲乳化，形成穩(wěn)定的乳白色初乳；并將初乳按1∶4的比例逐滴快速加入2%PVA溶液中，不斷攪拌使得有機(jī)溶劑快速蒸發(fā)，靜置后收集沉淀，用純凈水洗滌、離心、真空凍干得緩釋微球。

(3) 復(fù)合支架構(gòu)建：將上述制成的β-TCP骨支架用1%冰醋酸溶液配制的2%殼聚糖溶液浸泡，待完全浸濕后取出，放置在 37 ℃烘箱烘干。此操作重復(fù) 3 遍，使β-TCP空白支架包被一層帶正電荷的殼聚糖，將此殼聚糖包被過的支架放入離心管內(nèi)，同時(shí)滴入帶負(fù)電荷的 VAN/PLGA 緩釋微球蒸餾水懸液，輕微震蕩混勻10 min，使微球均勻吸附填充于支架孔隙內(nèi)，1000 r/min離心5 min，取出材料凍干；再將此負(fù)載有微球的支架浸泡入殼聚糖溶液中，待完全浸濕浸透后，取出凍干即得復(fù)合支架。

1.2.2 VAN/PLGA微球β-TCP復(fù)合支架的表征評(píng)價(jià)

(1) 形態(tài)學(xué)觀察：肉眼觀察復(fù)合支架的形態(tài)及大小，在支架表面進(jìn)行噴金處理后，通過電鏡觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

(2) 孔隙率測(cè)定：采用置換法測(cè)孔隙率。在潔凈干燥的比重瓶中裝滿乙醇，稱重為W1，將質(zhì)量為W0的復(fù)合支架浸入乙醇中，超聲除氣，使得支架孔隙充滿乙醇，再向比重瓶中補(bǔ)滿乙醇，稱重為W2，取出支架，剩余比重瓶稱重為W3，測(cè)得當(dāng)前溫度下乙醇密度為ρ0?？紫堵?(Φ，% ) =[(W2-W3-W0)/ρ0]/[(W1-W3)/ρ0]×100%。

(3) 載藥率、包封率的測(cè)定：取2 mg干燥VAN緩釋微球置于10 mL試管，加入二氯甲烷1 mL超聲振蕩溶解，加入PBS液4 mL快速混勻，靜置10 min，1000 r/min 離心5 min，取上清采用紫外分光光度儀測(cè)量260 nm處吸光度，重復(fù)3次取均值，繪制VAN標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算微球載藥率和包封率。載藥率=微球中藥物質(zhì)量/微球總質(zhì)量；包封率=微球中藥物總質(zhì)量/投入藥物總質(zhì)量。

(4) 藥物緩釋率測(cè)定：稱取一定量的復(fù)合支架置于離心管中，加入1 mL二氯甲烷溶解完全，再加入4 mL PBS溶液，離心取上清，測(cè)260 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算復(fù)合支架中VAN總含量。再稱取等量的緩釋微球和復(fù)合支架，分別加入5 mL PBS溶液，密封置于 37℃恒溫震蕩箱中孵育，每間隔2 d收集0.5 mL PBS溶液并用原有PBS補(bǔ)足至原來體積，樣品離心后取上清液，測(cè)260 nm 處測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算出藥物釋放量，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，平均值用來計(jì)算釋放率，釋放率=藥物釋放量/支架中總藥物量×100%。

(5) 力學(xué)性能測(cè)定：分別取3個(gè)β-TCP空白支架和β-TCP負(fù)載VAN/PLGA復(fù)合支架，應(yīng)用萬能材料力學(xué)試驗(yàn)機(jī)比較其力學(xué)性能，通過最大負(fù)荷和最大強(qiáng)度來衡量性能好壞。

(6) 體外降解實(shí)驗(yàn)：配置模擬體液(simulated body fluids,SBF)，分別取β-TCP空白支架和β-TCP負(fù)載VAN/PLGA微球復(fù)合支架樣本，稱重后浸入100 m L SBF溶液中，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。每周換液，并取出樣品真空干燥后稱重，記錄其質(zhì)量，待復(fù)合支架完全降解后，以降解時(shí)間為橫坐標(biāo)、質(zhì)量為縱坐標(biāo)繪制變化曲線圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)

3D打印多孔β-TCP支架外觀如圖1所示。支架呈白色立方體狀(A)，表觀體積為6 mm×6 mm×5 mm，在光鏡下放大10倍后可見支架表面有許多排列整齊、大小均一的孔隙(B)。

圖1 3D打印 β-TCP支架形態(tài)

β-TCP負(fù)載VAN/PLGA微球復(fù)合支架形態(tài)學(xué)觀察見圖2。由于3D打印的β-TCP支架外包被了一層帶正電荷的殼聚糖，它能與帶負(fù)電荷的VAN/PLGA微球互相吸附，使得支架表面和內(nèi)部空隙均勻地覆蓋了緩釋微球(A)；取其斷面在光學(xué)顯微鏡下放大10倍后就可清楚地看見β-TCP支架上分布著一層大小均勻的圓形顆粒(B)；將其在掃描電鏡下放大300倍后就能看到 β-TCP負(fù)載VAN/PLGA微球復(fù)合支架的內(nèi)部形態(tài)(B)。

圖2 β-TCP負(fù)載VAN/PLGA微球復(fù)合支架形態(tài)學(xué)觀察

2.2 孔隙率

通過液體置換法測(cè)量了β-TCP空白支架和β-TCP負(fù)載VAN/PLGA復(fù)合支架的平均孔隙率分別為(65.27±2.37)%和(55.39±1.76)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.552，P=0.032)。

2.3 藥物緩釋率

精密稱取一定量的VAN用PBS溶解，配置成濃度為10、20、40、80、160 μg/mL的溶液，分別測(cè)量其260 nm處的吸光度(A)，以VAN濃度為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。根據(jù)VAN 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得VAN/PLGA微球?qū)AN的藥物負(fù)載率為(17.42±1.85)%，包封率為(35.13±3.59)%。

圖3 VAN標(biāo)準(zhǔn)曲線

體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VAN微球的釋放率遠(yuǎn)高于β-TCP負(fù)載VAN/PLGA復(fù)合支架的釋放率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，由于殼聚糖對(duì)復(fù)合支架的包被逐漸減弱，釋放率也隨之增加，在24 d時(shí)VAN微球釋放率達(dá)80%，復(fù)合支架釋放率達(dá)50%，還可以繼續(xù)釋放，在體內(nèi)維持長(zhǎng)時(shí)間的抑菌效果，見圖4。

圖4 藥物累積釋放曲線

2.4 復(fù)合支架力學(xué)性能

力學(xué)性能結(jié)果表明，3D打印β-TCP支架最大負(fù)荷為(107.83±7.81)N，最大強(qiáng)度為(3.02±0.21)MPa；β-TCP負(fù)載VAN/PLGA復(fù)合支架最大負(fù)荷為(174.50±7.80)N，最大強(qiáng)度為(4.83±0.25)MPa，與空白支架相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.462，t=9.901，P<0.001)。

2.5 體外降解實(shí)驗(yàn)

體外降解實(shí)驗(yàn)可以看出，β-TCP空白支架和復(fù)合支架在SBF模擬液中均逐漸降解，早期降解速度較慢，隨時(shí)間的延長(zhǎng)降解速度也隨之加快，在14周時(shí)β-TCP空白支架已降解完全，而負(fù)載VAN/PLGA復(fù)合β-TCP支架第20周時(shí)才能徹底降解，見圖4。

圖4 體外降解曲線

3 討論

3D打印技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，特別是在醫(yī)療方面有較高的應(yīng)用價(jià)值，如髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、牙齒等的3D打印[11]。TCP作為日常鈣源之一，相比其他補(bǔ)鈣產(chǎn)品，其優(yōu)勢(shì)在于可同時(shí)提供鈣和磷，鈣和磷兩種礦物質(zhì)是骨骼形成的必需物質(zhì)，在體內(nèi)維持平衡非常重要[12]。大量實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)β-TCP 雖然可在骨骼接合界面產(chǎn)生分解、吸收和析出等反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)牢固結(jié)合，但其材質(zhì)比較脆，柔韌性能差，力學(xué)承受能力也較低，不容易塑型[13]。另有研究表明，PLGA包埋微球在體內(nèi)釋放時(shí)，可形成一種偏酸的液體環(huán)境，破壞體內(nèi)平衡，選取一種堿性物質(zhì)與其中和，則能有效維持體內(nèi)酸堿度平衡[14]。而殼聚糖是甲殼質(zhì)脫乙酰反應(yīng)后的產(chǎn)品，它作為一種天然高分子材料，具有良好的血液相容性、安全性和微生物降解等優(yōu)良性能，將β-TCP與殼聚糖復(fù)合后，可以調(diào)節(jié)支架機(jī)械強(qiáng)度、機(jī)械效率，滿足組織力學(xué)和生理需要[15]。

β-TCP負(fù)載VAN/PLGA緩釋微球復(fù)合支架能否用于臨床上治療感染性骨缺損需要多方面的考察。研究表明，由于3D打印支架多孔的存在，使得該支架的表面積較傳統(tǒng)支架大大增加，明顯提高了載藥量和緩釋時(shí)間，能夠長(zhǎng)時(shí)間起到骨修復(fù)作用[16]。還有研究證實(shí)，將β-TCP支架與VAN/PLGA微球結(jié)合后，相對(duì)于空白的β-TCP支架，復(fù)合支架承受的機(jī)械強(qiáng)度明顯增大，抗壓強(qiáng)度從2.90 MPa升高到4.19 MPa，韌性從0.17 MPa升高到1.44 MPa，改善了其力學(xué)性能的同時(shí)仍保持良好的生物活性和降解性能[17]。除了對(duì)復(fù)合支架載藥量、緩釋率及力學(xué)性能等的表征評(píng)價(jià)外，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究也是對(duì)復(fù)合支架骨修復(fù)能力評(píng)估的重要指標(biāo)。韓倩倩等[18]研究表明3D打印β-TCP復(fù)合淫羊藿苷支架植入股骨頭壞死模型兔體內(nèi)，可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化、抑制破骨細(xì)胞活性，同時(shí)促進(jìn)新生血管生成，具有促進(jìn)兔股骨頭壞死修復(fù)的作用。Samaszko-Fiertek等[19]將萬古霉素殼聚糖緩釋液加到培養(yǎng)金黃色葡萄球菌的固體培養(yǎng)基中，每隔24h測(cè)量抑菌圈大小，結(jié)果顯示萬古霉素殼聚糖緩釋微球可以抑制金黃色葡萄球菌的增長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)選用殼聚糖溶液去包被β-TCP支架，使支架表面附著一層帶正電荷的薄膜，該薄膜能與帶負(fù)電荷的VAN/PLGA微球互相吸引，形成一種具有抗感染功能的復(fù)合支架。同時(shí)，殼聚糖是一種堿性多糖聚合物，可在弱酸環(huán)境下溶解并產(chǎn)生堿性物質(zhì)，能中和PLGA釋放的酸性物質(zhì)，維持體內(nèi)酸堿度平衡。本實(shí)驗(yàn)中3D打印多孔β-TCP負(fù)載VAN/PLGA微球復(fù)合支架與β-TCP空白支架比較，孔隙率有所下降，其原因可能是空白支架孔隙中吸附了緩釋微球；復(fù)合支架最大負(fù)荷和最大強(qiáng)度均有所提升，主要原因是β-TCP與殼聚糖復(fù)合能增強(qiáng)支架韌性和強(qiáng)度，與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合。此外，負(fù)載VAN/PLGA微球的復(fù)合β-TCP支架體外降解時(shí)間有所延長(zhǎng)，并且在早期階段降解速度比空白β-TCP支架緩慢，提示殼聚糖包被VAN/PLGA膠囊能減緩釋藥物釋放速率，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的降解時(shí)間，減少機(jī)體因藥物不耐受而引起的不良反應(yīng)，長(zhǎng)時(shí)間起到抗菌修復(fù)作用。

4 結(jié)論

3D打印技術(shù)制作的多孔β-TCP負(fù)載VAN/PLGA緩釋微球復(fù)合支架具有良好的緩釋性能、力學(xué)性能和抗感染修復(fù)功能，能作為修復(fù)骨缺損的優(yōu)良材料。后期將對(duì)該復(fù)合支架進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(新西蘭兔)，觀察復(fù)合支架體內(nèi)局部抗感染效果、骨缺損修復(fù)能力，同時(shí)也為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，最終為感染性骨缺損的治療尋找一種全新的治療方法。