易佳，劉昆侖

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

米糠是糙米加工的主要副產(chǎn)物（占稻谷的10%），產(chǎn)量高，具有一定的營養(yǎng)價值，但其利用率低，多被用作飼料處理，造成了米糠資源浪費[1-2]。米糠蛋白在米糠營養(yǎng)物質(zhì)中占13%～18%，富含限制性氨基酸（賴氨酸），是一種優(yōu)質(zhì)的谷物蛋白[3]。米糠蛋白具有氨基酸組成合理、生物效價高及消化率高等優(yōu)點[4]。此外，米糠蛋白還具有低過敏性，可適用于易過敏人群及嬰幼兒。因此，充分提取米糠蛋白是改善米糠資源浪費、提高米糠資源利用率的有效途徑。

米糠蛋白中的二硫鍵使蛋白質(zhì)發(fā)生高度聚合，從而導(dǎo)致米糠蛋白提取率低、溶解性差[5]，在食品應(yīng)用方面受限制。提取米糠蛋白的方法主要有物理法、堿法、酶法等[6]。堿法會導(dǎo)致蛋白質(zhì)氨基酸之間反應(yīng)生成有毒物質(zhì)或變性；酶法會破壞米糠蛋白的天然結(jié)構(gòu)，從而影響其功能特性。相比于以上兩種方法，物理法提取具有減小米糠顆粒、打破米糠細胞結(jié)構(gòu)、維持米糠蛋白功能特性，且不引起蛋白質(zhì)變性等優(yōu)點，更適用于工業(yè)生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，超微粉碎能快速、高效地粉碎物料，保持物料原有的理化特性和活性物質(zhì)。相關(guān)研究表明，與普通粉碎相比，經(jīng)超微粉碎的酸棗仁蛋白質(zhì)提取率由69.71%提高至76.56%[7-8]。Bedin等[9]對比堿提、超聲波輔助堿提等方法，發(fā)現(xiàn)超聲波輔助提取能在較短時間內(nèi)獲得較高米糠蛋白提取率，且雜質(zhì)少，對米糠蛋白結(jié)構(gòu)破壞小。超聲波能產(chǎn)生高剪切力，破壞米糠細胞結(jié)構(gòu)[10]，增大米糠蛋白分子運動頻率和速度；超微粉碎能減小米糠顆粒、打破米糠結(jié)構(gòu)，提高米糠資源利用率[11]；研究表明[12-14]聯(lián)合兩種物理方法較單一物理法更能提高蛋白質(zhì)的提取率。

目前，超聲波和超微粉碎已廣泛應(yīng)用于活性物質(zhì)的提取，但兩者聯(lián)合作用提取米糠蛋白的報道較少。因此，為了提高米糠蛋白的提取率、加深米糠資源的利用率，本研究聯(lián)合超微粉碎和超聲波提取米糠蛋白，并采用響應(yīng)面法對米糠蛋白提取工藝進行優(yōu)化，確定米糠蛋白的高效提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮米糠：原陽縣八素米業(yè)有限公司；正己烷、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸（均為分析純）：四川西隴科學(xué)有限公司；考馬斯亮藍G-250：上海藍季科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WF-18小型超微粉碎機：溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司；JY92-IIN超聲波細胞粉碎機（變幅桿型號Φ10）：寧波新芝生物科技股份有限公司；Kjeltec 8400全自動凱式定氮儀：丹麥福斯公司；UV1800PC紫外可見分光光度計：上海菁華科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 米糠基本成分的測定

分別參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》、GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》、GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》和GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》測定米糠中的水分、灰分、蛋白質(zhì)和脂肪。

1.3.2 脫脂米糠的制備

新鮮米糠經(jīng)超微粉碎后，以1∶10（g/mL）的料液比加入正己烷，在（25±2）℃下對米糠進行振蕩脫脂3 h，重復(fù)3次，靜置30 min。上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正己烷，沉淀于通風(fēng)櫥晾干10 h，于-20℃密封保存。

1.3.3 米糠蛋白提取工藝流程

脫脂米糠→以一定料液比加入去離子水→以一定條件（超聲功率、超聲時間）進行超聲波處理（固定超聲間歇時間：2、2 s）→調(diào)節(jié)pH值至9.5→50℃水浴攪拌→5 000 r/min離心30 min→收集上清液，定容→測定上清液中蛋白質(zhì)含量，計算提取率→酸沉，調(diào)節(jié)pH值為4.5→冷凍干燥→-20℃貯藏、備用。

1.3.4 米糠蛋白提取率的測定

采用GB 5009.5—2016中的凱式定氮法測定蛋白質(zhì)含量，米糠蛋白提取率按公式（1）計算。

1.3.5 單因素試驗

選擇料液比 [1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）]、超聲功率（65、130、195、260、325 W）、超聲時間（4、8、12、16、20 min）和提取時間（1、2、3、4、5 h）進行單因素試驗，探究各因素對米糠蛋白提取率的影響。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

選取料液比、提取時間和超聲時間為優(yōu)化因素，利用響應(yīng)面法優(yōu)化米糠蛋白提取工藝。保持超聲功率為130 W，以米糠蛋白提取率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計進行試驗。因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平Table 1 Response surface factor level

1.3.7 蛋白質(zhì)溶解度

配制10 mg/mL的米糠蛋白溶液（以pH7.0的磷酸緩沖液配制），（25±2）℃下振蕩 30 min，離心 10 min（4 000 r/min），取上清液，經(jīng)考馬斯亮藍G-250染色后，測定可溶性蛋白質(zhì)量[15]，溶解度根據(jù)公式（2）計算。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復(fù)3次，取平均值。采用SPSS 23.0進行顯著性分析（P＜0.05），Design-Expert 10.0.1進行響應(yīng)面設(shè)計、方差分析及預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠基本成分測定結(jié)果

米糠基本成分測定結(jié)果見表2。

表2 基本成分的測定Table 2 Determination of basic components

如表2所示，原料米糠中水分、灰分、蛋白質(zhì)和脂肪分別為10.68%、9.56%、13.68%和21.36%。

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對米糠蛋白提取率的影響

料液比對米糠蛋白提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對米糠蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of rice bran protein

由圖1可知，當溶劑用量較少時，反應(yīng)體系因淀粉及纖維素等物質(zhì)[16]吸水膨脹變黏稠，導(dǎo)致流動性變差，蛋白分子擴散變慢，米糠蛋白無法充分溶出，從而降低了蛋白提取率；當料液比為1∶50（g/mL）時，反應(yīng)體系黏度降低、物料流動性增強且充分擴散[17]，增加了溶液中物質(zhì)的傳質(zhì)速度，從而提高了米糠蛋白的提取率；但繼續(xù)增加溶劑用量時，其他非蛋白物質(zhì)溶出[18]，阻礙了米糠蛋白的溶出，從而導(dǎo)致蛋白提取率降低。因此，提取工藝最佳料液比確定為1∶50（g/mL）。

2.2.2 超聲功率對米糠蛋白提取率的影響

超聲功率對米糠蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 超聲功率對米糠蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction rate of rice bran protein

由圖2可知，當超聲功率增加至130 W時，超聲波的空化效應(yīng)破壞了米糠細胞，加快了傳質(zhì)速度，促進了細胞內(nèi)容物溶出，增大了物質(zhì)和液體之間的接觸面，從而進一步提高了米糠蛋白提取率[19-20]；超聲功率繼續(xù)增加，過強的剪切力破壞了米糠蛋白的高級結(jié)構(gòu)[10，21]，且反應(yīng)體系溫度升高，米糠中淀粉發(fā)生糊化，使蛋白質(zhì)溶出受到阻礙，從而導(dǎo)致米糠蛋白提取率下降。因此，提取工藝最佳超聲功率確定為130 W。

2.2.3 超聲時間對米糠蛋白提取率的影響

超聲時間對米糠蛋白提取率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對米糠蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of rice bran protein

由圖3可知，米糠蛋白提取率隨超聲時間的延長有明顯變化。在料液比為1∶50（g/mL）、超聲功率為130 W的條件下，當超聲時間延長至12 min時，超聲波的空化效應(yīng)逐漸增強，使米糠蛋白與淀粉、纖維素等結(jié)合物分離[22]，且空化氣泡破裂所產(chǎn)生的壓力使米糠結(jié)構(gòu)變得疏松[10]，引入了大量溶劑，增大了細胞內(nèi)物質(zhì)與溶劑的接觸面，促進了米糠蛋白的溶出；而當超聲時間過長時，超聲所伴隨的熱量過高，使米糠蛋白發(fā)生變性[22]，導(dǎo)致米糠蛋白提取率下降。因此，提取工藝最佳超聲時間確定為12 min。

2.2.4 提取時間對米糠蛋白提取率的影響

提取時間對米糠蛋白提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對米糠蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of rice bran protein

在料液比1∶50（g/mL）、超聲功率130 W及超聲時間12 min的條件下，提取時間對米糠蛋白提取率有明顯影響。由圖4可知，當提取時間較短時（1h～2 h），米糠蛋白與其結(jié)合物的分離程度較小[23]，導(dǎo)致提取率較低；隨著提取時間增至4 h，長時間地浸泡使米糠結(jié)構(gòu)變疏松，米糠蛋白大量溶出，導(dǎo)致米糠蛋白提取率逐漸上升；但當提取時間超過4 h時，米糠蛋白因其高聚合活性發(fā)生聚集沉淀[18，24]，進而導(dǎo)致米糠蛋白提取率降低。因此，提取工藝最佳提取時間確定為4 h。

2.3 響應(yīng)面試驗及結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗，選擇料液比、超聲時間及提取時間進行響應(yīng)面Box-Behnken優(yōu)化試驗，其中固定超聲功率為130 W，以米糠蛋白提取率為優(yōu)化指標。試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Test design and results

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

利用軟件Design-Expert 10.0.1對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，得到擬合后的二次多項回歸方程為Y=63.20+0.70X1-0.059X2-0.57X3+0.52X1X2-0.30X1X3+0.43X2X3-0.99X12-1.67X22-0.37X32。由表4可知，該回歸模型極顯著（P＜0.0001），且模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9827，R2adj=0.960 5，說明該模型置信度高。因此，超微超聲輔助提取工藝可用該模型進行分析和預(yù)測。根據(jù)F值的大小可以判斷出各因素對米糠蛋白提取率的影響程度：X1＞X3＞X2，即料液比＞超聲時間＞提取時間。根據(jù) P值可以看出，X1、X3影響極顯著（P＜0.01），X2影響不顯著（P＞0.05）；X1和X2的交互作用對Y值的影響極顯著（P＜0.01），X2和 X3的交互作用顯著（P＜0.05），而 X1和X3的交互作用不顯著（P＞0.05），可能是由于因素的主效應(yīng)大于因素間的相互作用。

圖5是各因素影響米糠蛋白提取率的直觀反映。根據(jù)響應(yīng)曲面坡度及等高線密度可判斷交互作用是否顯著，坡度越陡、密度越密，交互作用越顯著。

圖5 各因素交互作用響應(yīng)面Fig.5 Response surface of interaction of factors

由圖5可知，料液比和提取時間、提取時間和超聲時間的交互作用顯著，料液比和超聲時間的交互作用不顯著，其結(jié)論與方差分析相符。

2.4 最佳工藝條件的確定及驗證

對該回歸模型進行計算，得最佳提取工藝為料液比1∶56.52（g/mL）、提取時間 4.06h、超聲時間9.28min。根據(jù)實際可操作性，修改工藝參數(shù)為料液比1∶57（g/mL）、提取時間4 h、超聲時間9 min。經(jīng)多次驗證試驗，米糠蛋白提取率為（64.31±0.18）%，與預(yù)測結(jié)果63.58%接近。說明該回歸模型能準確預(yù)測試驗結(jié)果。因此，確定最佳工藝參數(shù)為料液比1∶57（g/mL）、提取時間4 h、超聲時間9 min。

2.5 提取方法比較

將超微聯(lián)合超聲提取與傳統(tǒng)堿溶酸沉提取的米糠蛋白進行比較，以蛋白提取率、蛋白純度和蛋白溶解度為比較參數(shù)，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，經(jīng)超微聯(lián)合超聲提取，米糠蛋白提取率有極顯著提升，由傳統(tǒng)堿溶酸沉提取的45.41%提升到64.31%，提高了41.62%。超微粉碎減小了米糠粒徑，增大了米糠與堿液的接觸面，使得米糠蛋白更易提??；同時由于超聲波的空化效應(yīng)加快了米糠混合液的傳質(zhì)速度，加速了米糠蛋白的溶出，并且破壞了米糠蛋白與其他非蛋白物質(zhì)的聚集體，使得酸沉下來的蛋白質(zhì)純度升高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超微聯(lián)合超聲提取的米糠蛋白溶解度為25.49%，相比堿溶酸沉法有明顯提升。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)超微聯(lián)合超聲提取能有效提高米糠蛋白的提取率。通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化后，得到最佳提取工藝：料液比 1∶57（g/mL）、提取時間4 h、超聲時間9min。最終米糠蛋白提取率為（64.31±0.18）%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超微聯(lián)合超聲提取后，米糠蛋白的提取率、純度及溶解度較傳統(tǒng)堿溶酸沉提取有所提高。本研究有效提高了米糠蛋白的提取率，同時發(fā)現(xiàn)經(jīng)此提取，其溶解度有所改善，后續(xù)將對米糠蛋白的增溶工藝進行探究，為米糠蛋白質(zhì)資源的精加工及利用提供參考。