陳佳楠，馮敏，張超，徐保國(guó)*，周存山，馬海樂(lè)

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)食品物理加工研究院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

草莓顏色鮮艷、柔軟多汁，富含對(duì)健康有益的活性成分（維生素、礦物質(zhì)、酚、類黃酮等），素有“漿果皇后”的美稱[1]。新鮮草莓的水分含量達(dá)90%以上，且極易腐爛變質(zhì)，將草莓加工成草莓汁是一種有潛力的草莓深加工形式。

酶處理廣泛應(yīng)用于果汁制造，以提高果汁產(chǎn)量并降低果汁黏度，從而改善管路輸送，過(guò)濾和包裝，從工業(yè)和加工角度來(lái)看十分重要[2]。此外，酶通常用于漿果類果汁生產(chǎn)，酶處理所得的果汁可以通過(guò)離心或過(guò)濾得到清汁。澄清后，果汁的澄清度、香氣和風(fēng)味等均增加[3]。酶解技術(shù)具有分解果肉細(xì)胞物質(zhì)的能力，不同種類的酶制劑在果汁處理過(guò)程中具有特異性作用。常用于果汁加工的酶制劑有果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶等，均可降解形成細(xì)胞壁網(wǎng)絡(luò)的多糖，釋放果汁和糖苷結(jié)合的化合物[4]。果膠酶是一類水解酶，可催化果膠中α-1，4-糖苷鍵的裂解，生成聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸等[5]；而纖維素酶催化纖維素鏈中α-1，4鍵的水解，產(chǎn)生低聚糖、纖維素二糖和葡萄糖[6]。單一酶加入的酶解效果往往具有局限性，而復(fù)合酶之間的協(xié)同作用可以彌補(bǔ)這一缺陷[7-9]。因此，本文旨在探究適合草莓酶解的復(fù)合酶和酶解條件，以提高草莓的出汁率和澄清度，為開(kāi)發(fā)草莓汁工藝研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅顏草莓（Fragaria×ananassa Duch.）購(gòu)自江蘇省丹陽(yáng)市草莓農(nóng)場(chǎng)，選擇大小和顏色均勻且無(wú)機(jī)械損傷的成熟草莓作為試驗(yàn)對(duì)象，儲(chǔ)存于4℃的冰箱中備用；果膠酶（30 000 U/g）、纖維素酶（10 000 U/g）、木聚糖酶（10 000 U/g）：上海麥克林生物科技有限公司；抗壞血酸：鎮(zhèn)江國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WBL2501B型料理機(jī)：廣東美的生活電器制造有限公司；DL-5C型冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；CPA1003P型電子天平：德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；PHS-3C型pH計(jì)、WAY-2S型阿貝折光儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DDS-11AT數(shù)字電導(dǎo)率儀：上海雷磁新涇儀器有限公司；T6新世紀(jì)型紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 草莓的品質(zhì)特性測(cè)定

在室溫（20℃）下，采用pH計(jì)測(cè)定草莓打漿后的pH值；水分含量參照王旭樂(lè)[10]的干燥法；可溶性固形物采用阿貝折光儀進(jìn)行測(cè)定[11]，以白利糖度（°Brix）為單位表示；電導(dǎo)率用電導(dǎo)率儀測(cè)定[12]，以ms/cm為單位表示；可滴定酸采用NaOH滴定法測(cè)定[13]；還原性糖采用蒽酮-硫酸顯色法測(cè)定[14]。

1.3.2 草莓汁的制備

取適量的草莓，去除花萼和果梗、洗凈表面雜質(zhì)、瀝干并切成小塊，按料液比2∶1（g/mL）加水打漿，并加入0.05%抗壞血酸護(hù)色，再加入一定量的果膠酶和纖維素酶，攪拌均勻，然后將其放入水浴鍋中進(jìn)行酶解反應(yīng)，酶解結(jié)束后迅速用冷水降到室溫（20℃），8 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)兩層紗布過(guò)濾，得到草莓汁。

1.3.3 草莓汁出汁率的測(cè)定

參照Bora等[15]的方法測(cè)定出汁率，計(jì)算公式如下。

1.3.4 草莓汁澄清度的測(cè)定

在660 nm處測(cè)量果汁的透光率，以透光率T（%）表示果汁的澄清度[16]。

1.3.5 酶解單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶3種不同的酶制劑并且兩兩復(fù)合，在酶解溫度25℃、酶解時(shí)間30 min，固定酶添加量為0.12%的初始酶解條件基礎(chǔ)上，研究酶制劑對(duì)草莓汁出汁率和澄清度的影響，找出最適酶制劑進(jìn)行復(fù)合。

分別以復(fù)合酶質(zhì)量比（1∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1、2 ∶3、3∶2）、復(fù)合酶添加量（0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.20%、0.24%）、酶解溫度（25、30、35、40、45、50 ℃）、酶解時(shí)間（20、25、30、35、40、45 min）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各指標(biāo)對(duì)草莓出汁率和澄清度的影響。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取復(fù)合酶添加量（A）、復(fù)合酶質(zhì)量比（B）、酶解溫度（C）、酶解時(shí)間（D）為自變量，以草莓出汁率（Y1）和澄清度（Y2）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，編碼水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels in the optimization test by response surface methodology

1.3.7 感官評(píng)價(jià)

參考GB/T 10221—2021《感官分析 術(shù)語(yǔ)》、李雨浩[17]和Laaksonen等[18]的方法，使用九點(diǎn)快感標(biāo)度法評(píng)估草莓汁樣品的感官特性。由20名（10男10女）經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的評(píng)價(jià)員，根據(jù)草莓汁的感官特征分別從9個(gè)感官指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，每個(gè)指標(biāo)按強(qiáng)度分級(jí)，從0～10分進(jìn)行打分，具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 草莓汁的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of strawberry juice

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

每組試驗(yàn)進(jìn)行3次，使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。比較組間的單因素方差和鄧肯分析，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。使用Origin 2021作圖，描繪各試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變化情況。采用Design-Expert 11軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓的品質(zhì)特性分析

本試驗(yàn)所采用的草莓原料的品質(zhì)特性分析見(jiàn)表3。

表3 草莓的品質(zhì)特性Table 3 Quality characteristics of strawberries

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 不同酶制劑對(duì)草莓出汁率和澄清度的影響

不同酶制劑對(duì)草莓出汁率和澄清度的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同酶制劑對(duì)草莓出汁率和澄清度的影響Fig.1 Effects of different enzyme preparations on strawberry juice yield and clarity

由圖1可知，在單一酶中果膠酶的出汁率最高，其次是纖維素酶和木聚糖酶，果膠酶的酶解效果比纖維素酶更好，主要是因?yàn)樵诓葺庵校z含量比纖維素高。因此，果膠的降解對(duì)于從細(xì)胞中釋放果汁更為重要。復(fù)合酶的酶解效果明顯高于單一酶解，其中果膠酶和纖維素酶復(fù)合后，出汁率最高，從對(duì)照組的64.16%提高到87.38%。與對(duì)照組相比，果膠酶處理的澄清度顯著升高（p＜0.05），其他單一酶的效果并不顯著（p＞0.05）。果膠酶和纖維素酶復(fù)合的澄清度最高，從對(duì)照組的2.34%提高到72.83%。在香蕉汁中，Bora等[15]通過(guò)果膠酶和纖維素酶聯(lián)合處理來(lái)改善澄清度。綜合考慮不同酶制劑對(duì)出汁率和澄清度的影響，最終選擇果膠酶和纖維素酶進(jìn)行復(fù)合，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞壁化合物的最大分解。

2.2.2 復(fù)合酶質(zhì)量比對(duì)草莓出汁率和澄清度的影響

復(fù)合酶質(zhì)量比對(duì)草莓出汁率和澄清度的影響見(jiàn)圖2。

圖2 復(fù)合酶比例對(duì)草莓出汁率和澄清度的影響Fig.2 Effect of ratio of complex enzymes on strawberry juice yield and clarity

由圖2可知，當(dāng)果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比為3∶1時(shí)，草莓出汁率最高，為90.31%。由于果膠酶比纖維素酶在增加草莓出汁率方面更有效，草莓出汁率隨著果膠酶占比的增加而呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，當(dāng)果膠酶占比過(guò)高時(shí)，又不足以破壞草莓細(xì)胞壁中的纖維素結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致出汁率低。草莓汁的澄清度也隨著復(fù)合酶質(zhì)量比的不同而變化，質(zhì)量比為3∶1時(shí)，草莓汁的澄清度為88.39%，顯著高于其他復(fù)合酶質(zhì)量比的澄清度（p＜0.05），澄清度主要受果膠的影響較大，因此綜合考慮，選取2∶1、3∶1、4∶1為響應(yīng)面試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.2.3 復(fù)合酶添加量對(duì)草莓出汁率和澄清度的影響

復(fù)合酶添加量對(duì)草莓出汁率和澄清度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶添加量對(duì)草莓出汁率和澄清度的影響Fig.3 Effect of enzyme addition amount on strawberry juice yield and clarity

由圖3可知，隨著復(fù)合酶添加量的增加，草莓的出汁率和澄清度先增加后降低。在復(fù)合酶添加量為0.16%時(shí)，草莓出汁率最高，為89.09%，顯著高于其他復(fù)合酶添加量（p＜0.05）；當(dāng)添加量為0.20%時(shí)，草莓汁的澄清度達(dá)到最大，為90.66%。當(dāng)復(fù)合酶添加量過(guò)低時(shí)，酶促反應(yīng)不足，草莓中的果膠無(wú)法完全分解，而當(dāng)復(fù)合酶添加量過(guò)高時(shí)，由于草莓汁的pH值太低，未反應(yīng)的酶會(huì)形成酶蛋白沉淀[19]，這些都會(huì)導(dǎo)致草莓出汁率低、澄清度差。因此選取0.12%、0.16%、0.20%為響應(yīng)面試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.2.4 酶解溫度對(duì)草莓出汁率和澄清度的影響

酶解溫度對(duì)草莓出汁率和澄清度的影響見(jiàn)圖4。

圖4 酶解溫度對(duì)草莓出汁率和澄清度的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on strawberry juice yield and clarity

由圖4可知，在酶解溫度為25℃～45℃時(shí)，草莓的出汁率隨著酶解溫度的升高而顯著上升（p＜0.05），當(dāng)溫度達(dá)到45℃后出汁率開(kāi)始下降，45℃時(shí)出汁率為最高值90.51%。可見(jiàn)溫度對(duì)酶活性有一定影響，溫度過(guò)低或過(guò)高均會(huì)影響酶活力，從而導(dǎo)致酶解能力下降。酶解溫度為30℃時(shí)，澄清度最高，為78.88%。隨后呈緩慢下降的趨勢(shì)，這與溫度升高導(dǎo)致的草莓可溶性固形物含量增加有密切關(guān)系，而且溫度升高會(huì)引起絮凝沉淀物的部分重新溶解[20]，從而透光率降低。綜合考慮草莓汁在較高溫度下酶解，會(huì)影響草莓品質(zhì)，因此選擇35、40、45℃為響應(yīng)面試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)草莓出汁率和澄清度的影響

酶解時(shí)間對(duì)草莓出汁率和澄清度的影響見(jiàn)圖5。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)草莓出汁率和澄清度的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on strawberry juice yield and clarity

由圖5可知，20 min～35 min時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，草莓出汁率迅速升高，35 min后逐漸趨于平穩(wěn)并逐漸下降。酶解35 min時(shí)，草莓出汁率最高，為89.66%。但在 35 min～40 min 時(shí)，出汁率無(wú)顯著變化（p＞0.05）。草莓的澄清度呈先降低后升高又降低的趨勢(shì)，所以酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成草莓澄清度降低，營(yíng)養(yǎng)成分也可能損失。綜合考慮草莓汁的酶解時(shí)間越長(zhǎng)，越容易造成氧化褐變，因此選擇20、30、40 min為響應(yīng)面試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.3 草莓酶解工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取復(fù)合酶添加量、復(fù)合酶質(zhì)量比、酶解溫度、酶解時(shí)間為自變量，以草莓出汁率和澄清度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results for response surface methodology

續(xù)表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 4 Design and results for response surface methodology

應(yīng)用Design-Expert 11軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到草莓出汁率（Y1）和澄清度（Y2）與復(fù)合酶添加量（A）、復(fù)合酶質(zhì)量比（B）、酶解溫度（C）、酶解時(shí)間（D）之間的二次多項(xiàng)式回歸方程如下。

2.3.2 響應(yīng)面方差分析

對(duì)草莓出汁率和澄清度的方差分析結(jié)果見(jiàn)表5和表6。

表5 草莓出汁率的方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis results of strawberry juice yield

表6 草莓汁澄清度的方差分析結(jié)果Table 6 Variance analysis results of strawberry juice clarity

由表5和表6可知，兩個(gè)模型的p＜0.000 1，說(shuō)明回歸方程極顯著，失擬項(xiàng)的p＞0.05表明差異不顯著，說(shuō)明模型擬合度較好，試驗(yàn)誤差較小。由方差分析p結(jié)果可知，在影響草莓出汁率的各項(xiàng)因素中，B、CD、B2對(duì)草莓出汁率的影響顯著；A、C、D、AD、A2、C2、D2對(duì)草莓出汁率的影響極顯著；其余因素均對(duì)草莓出汁率不顯著。在影響草莓汁澄清度的各項(xiàng)因素中，A、BC對(duì)草莓汁澄清度的影響顯著；B、C、D、BD、CD、A2、B2、C2、D2對(duì)草莓汁澄清度的影響極顯著；其余因素均對(duì)草莓汁澄清度不顯著。根據(jù)F值的大小得出各因素對(duì)出汁率的影響順序?yàn)槊附鉁囟龋久附鈺r(shí)間＞復(fù)合酶添加量＞復(fù)合酶質(zhì)量比，對(duì)澄清度的影響順序?yàn)槊附鈺r(shí)間＞復(fù)合酶質(zhì)量比＞酶解溫度＞復(fù)合酶添加量。

2.3.3 響應(yīng)曲面分析

各因素之間的交互作用對(duì)草莓出汁率和澄清度的等高線圖和三維響應(yīng)面圖見(jiàn)圖6和圖7。

圖6 各因素對(duì)草莓出汁率交互作用的等高線圖和三維響應(yīng)面圖Fig.6 Contour diagrams and three-dimensional response surface diagrams of the interaction of various factors on strawberry juice yield

圖7 各因素對(duì)草莓澄清度交互作用的等高線圖和三維響應(yīng)面圖Fig.7 Contour diagrams and three-dimensional response surface diagrams of the interaction of various factors on strawberry juice clarity

從圖6和圖7中的橢圓形狀可以看出各因素交互作用的強(qiáng)弱，越接近橢圓表示交互作用越顯著，若呈現(xiàn)圓形則交互作用不顯著；三維響應(yīng)面圖的坡度越陡峭，說(shuō)明因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大[21]。綜合各因素對(duì)草莓出汁率和澄清度的綜合影響，通過(guò)軟件分析對(duì)兩個(gè)回歸方程進(jìn)行極大值求解，得到最佳酶解條件為復(fù)合酶添加量為0.17%、復(fù)合酶質(zhì)量比為3.27∶1、酶解溫度為41.03℃、酶解時(shí)間為34.02 min，此條件下草莓出汁率的預(yù)測(cè)值為90.72%，澄清度的預(yù)測(cè)值為84.79%。根據(jù)實(shí)際情況，將酶解條件修正為復(fù)合酶添加量0.17%、復(fù)合酶質(zhì)量比3∶1、酶解溫度41℃、酶解時(shí)間35 min。

2.3.4 結(jié)果優(yōu)化與驗(yàn)證

為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性，在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，所得草莓出汁率為（90.84±0.45）%，澄清度為（84.61±0.63）%，試驗(yàn)結(jié)果與模型方程的理論值基本吻合，進(jìn)一步證明模型的可靠性。

2.4 感官評(píng)價(jià)分析

4種不同酶酶解的草莓汁的感官評(píng)分見(jiàn)表7。

表7 草莓汁的感官評(píng)分Table 7 Sensory scores of strawberry juice

由表7可知，未經(jīng)酶處理（對(duì)照組）的草莓汁與酶處理組有很大不同，對(duì)照組的草莓汁澄清度較差、酸味較大、苦味較小、風(fēng)味較弱。果汁具有大部分的酸和甜的特性，而澀味主要是來(lái)自果皮部分和大量的酚類化合物，果膠能結(jié)合多酚類物質(zhì)，從而降低對(duì)澀味的感知[22]，所以果膠酶的加入可能同時(shí)增加澀味。還有研究發(fā)現(xiàn)酶處理是果汁香氣改變的主要原因，而短期熱處理不會(huì)影響果汁氣味[23]。在本研究中，不同酶酶解的草莓汁的澀味和氣味無(wú)顯著差異（p＞0.05）。與對(duì)照組相比，不同酶酶解的草莓汁的綜合評(píng)分呈現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05），綜合來(lái)看，纖維素酶酶解后具備較好的甜味，果膠酶酶解后色澤、澄清度更高，澀味、氣味沒(méi)有顯著性差異，復(fù)合酶綜合了兩種酶的優(yōu)點(diǎn)，綜合評(píng)分相對(duì)最高，為7.36±1.12，整體風(fēng)味及口感更優(yōu)。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了草莓汁酶解工藝中復(fù)合酶的種類，與單一的酶制劑相比，復(fù)合酶明顯提高了草莓的出汁率和澄清度，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化，確定復(fù)合酶最佳酶解條件為復(fù)合酶添加量為0.17%、復(fù)合酶（果膠酶與纖維素酶）質(zhì)量比為3∶1、酶解溫度為41℃、酶解時(shí)間為35 min，此條件下草莓出汁率為90.84%，澄清度為84.61%。與優(yōu)化前相比，出汁率和澄清度分別提高了6.93%和32.20%。使用九點(diǎn)快感標(biāo)度法評(píng)估草莓汁的感官特性，結(jié)果表明復(fù)合酶的感官評(píng)分最高，整體風(fēng)味及口感更優(yōu)。