肖建旭 ， 孫艷爭(zhēng)

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 河北 保定 071000 ； 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)感染包括家養(yǎng)動(dòng)物、野生動(dòng)物和人類在內(nèi)的幾乎所有溫血?jiǎng)游?。近年?lái)，臨沂動(dòng)植物園內(nèi)野生動(dòng)物如斑馬、梅花鹿、平頂猴等頻繁出現(xiàn)流產(chǎn)，而弓形蟲(chóng)病又是引起動(dòng)物流產(chǎn)的主要原因之一，弓形蟲(chóng)一旦在園區(qū)內(nèi)流行極可能造成人獸共患風(fēng)險(xiǎn)，因此本試驗(yàn)對(duì)臨沂動(dòng)植物園珍稀野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染情況進(jìn)行調(diào)查。被譽(yù)為弓形蟲(chóng)檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)的改良凝集試驗(yàn)(MAT)是臨床和流行病學(xué)調(diào)查中最常用于檢測(cè)弓形蟲(chóng)的方法之一[1]，所以本調(diào)查在檢測(cè)園內(nèi)181只珍稀野生動(dòng)物和園內(nèi)流浪貓弓形蟲(chóng)IgG抗體水平時(shí)采用了MAT法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備和器材 熒光倒置顯微鏡(X71型號(hào))，日本Olympus公司；水套式二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；高速冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5810R)，德國(guó)Eppendorf公司；冰箱(BCD-238S)，海爾集團(tuán)；微量移液器，德國(guó)Eppendorf公司；電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.1.2 試劑及材料 Vero細(xì)胞，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)汪明教授惠贈(zèng)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。弓形蟲(chóng)RH株速殖子，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)劉群教授惠贈(zèng)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液，均購(gòu)自賽默飛世爾生物制品有限公司；胎牛血清，購(gòu)自德國(guó)PAN-Biotech GmhH公司；100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔U型微量板，均購(gòu)自Coming公司；β-羥基乙醇，購(gòu)自北京奧科斯科技有限公司。福爾馬林溶液：PBS和甲醛溶液按照6∶1配比。伊文思藍(lán)染液：在100 mL PBS溶液中添加0.2 g伊文思藍(lán)粉末，混合均勻。堿性緩沖液：含7.01 g NaCl、3.09 g H3BO3、2 g NaN3和4 g牛血清白蛋白，用24 mL 1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至8.95，加入H2O2定容至1 000 mL，置于4～6oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 調(diào)查對(duì)象 包括2個(gè)綱12個(gè)目20個(gè)科43種珍稀野生動(dòng)物181頭(只)和流浪貓41只。每只動(dòng)物靜脈采血0.5～2 mL，3 000 r/min離心5 min，分離血清，-20 ℃保存待檢。以上動(dòng)物均于2019年捕獲檢測(cè)，全部來(lái)源于臨沂動(dòng)植物園園區(qū)內(nèi)，試驗(yàn)結(jié)束后全部放歸園區(qū)，在動(dòng)物館舍內(nèi)飼養(yǎng)。

1.3 MAT檢測(cè)

1.3.1 Vero細(xì)胞擴(kuò)增弓形蟲(chóng)速殖子 當(dāng)Vero細(xì)胞單層鋪滿至80%左右時(shí)，接種弓形蟲(chóng)RH株速殖子，接種量為106～107個(gè)/瓶，待速殖子入侵細(xì)胞，細(xì)胞破裂釋放出速殖子后，收集培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的懸液，然后以2 500 r/min離心10 min，棄去上清，加20倍沉淀體積的PBS進(jìn)行洗滌，離心棄去上清，加適量PBS重懸沉淀，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 MAT抗原懸液制備 收集到的弓形蟲(chóng)速殖子懸液經(jīng)過(guò)10 mL注射器吹打，去除其中的細(xì)胞碎片，以2 500 r/min離心10 min，棄去上清，沉淀按1∶6加入福爾馬林溶液固定24 h。將固定的速殖子懸液以2 500 r/min離心10 min，棄去上清，加入PBS重懸沉淀，2 500 r/min離心10 min，以上操作重復(fù)3次。最后用堿性緩沖液調(diào)整速殖子濃度為107個(gè)/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 MAT法檢測(cè)弓形蟲(chóng)IgG抗體 96孔U型板中加入25 μL待檢血清，稀釋倍數(shù)分別為1∶20～1∶2 560，然后加入10 μL新鮮配制的抗原液(70 μL 2-巰基乙醇，100 μL 0.2%伊文思藍(lán)，1 mL 1.3.2中制備的抗原懸液)，振蕩混合均勻，用鋁錫紙密封，置于37 ℃保存，于24～72 h后觀察結(jié)果。結(jié)果判定：若抗原抗體結(jié)合物如地毯狀平鋪于孔底則為陽(yáng)性；若抗原抗體結(jié)合物在孔底為紐扣狀的凝集物則為陰性[2]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，技術(shù)資料用樣本數(shù)和陽(yáng)性率表示。采用單因素方差分析，比較館舍開(kāi)放程度、季節(jié)和飼料等因素對(duì)弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率的影響。P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 珍稀野生動(dòng)物和流浪貓弓形蟲(chóng)感染情況 本試驗(yàn)共對(duì)181頭(只)珍稀野生動(dòng)物和41只流浪貓的血液樣本進(jìn)行弓形蟲(chóng)IgG抗體檢測(cè)，珍稀野生動(dòng)物中一級(jí)動(dòng)物有14種61頭(只)，二級(jí)動(dòng)物有21種95頭(只)，三有保護(hù)動(dòng)物及山東省重點(diǎn)動(dòng)物有8種25頭(只)。結(jié)果如表1所示，臨沂動(dòng)植物園珍稀野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率為38.12%；41只流浪貓弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率為21.95%。主要檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 不同種屬動(dòng)物弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率分析 不同種屬動(dòng)物弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率從高到低排序：雞形目54.55%、雁形目52.27%、偶蹄目47.06%、鶴形目42.86%、靈長(zhǎng)目33.33%、有袋目20.00%、鸛形目16.67%、肉食目4.76%、長(zhǎng)鼻目0。

2.3 館舍開(kāi)放程度、食性、季節(jié)與弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率的關(guān)系分析 本調(diào)查中有101頭(只)野生動(dòng)物生活在半封閉性館舍內(nèi)，其弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率為51.49%，其余80頭(只)野生動(dòng)物生活在全封閉性館舍內(nèi)，其弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率為26.25%，二者的陽(yáng)性率差異顯著(P<0.05)。草食類和鳥(niǎo)類動(dòng)物弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率(47.06%和44.05%)明顯高于肉食類動(dòng)物弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率(4.76%)。按照動(dòng)物食性不同，弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率從高到低排序?yàn)橹彩承詣?dòng)物(44.83%)>雜食性動(dòng)物(33.33%)>肉食性動(dòng)物(4.76%)，其中植食性動(dòng)物和肉食性動(dòng)物的陽(yáng)性率差異顯著(P<0.05)，雜食性動(dòng)物和肉食性動(dòng)物的陽(yáng)性率差異顯著(P<0.05)。同年夏冬兩季分別檢測(cè)黑頸天鵝、黑天鵝、大白天鵝和疣鼻天鵝4種珍禽的弓形蟲(chóng)感染情況，夏季弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率分別是60.00%、28.57%、0、25.00%，冬季弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率分別是100%、100%、33.33%和44.44%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，夏季和冬季弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率差異極顯著(x2=7.291，P=0.007)。

2.4 不同性別、季節(jié)和生活地點(diǎn)流浪貓弓形蟲(chóng)感染情況 雄性流浪貓弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率為21.42%，雌性流浪貓弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率為23.08%，二者差異不顯著(x2=0.906，P>0.05)。按照采樣檢查時(shí)間的分布，得出不同季節(jié)的流浪貓弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率分別為春季50.00%、夏季0、秋季16.67%和冬季30.77%。不同季節(jié)流浪貓弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率差異顯著(P<0.05)。根據(jù)流浪貓主要生活地點(diǎn)劃分，弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率分別為百鳥(niǎo)園33.33%、天鵝湖28.57%、食草動(dòng)物散養(yǎng)區(qū)37.50%、獅虎山0、草食區(qū)14.29%、飼料室50.00%和廣場(chǎng)0。

表1 臨沂動(dòng)植物園主要珍稀野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)IgG抗體檢測(cè)Table 1 Seroprevalence of T. gondii antibodies in rare wild animals in Linyi Zoological and Botanical Garden

2.5 流浪貓與野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染情況相關(guān)性分析 根據(jù)野生動(dòng)物館舍分布情況和流浪貓主要生活地點(diǎn)，選取百鳥(niǎo)園、天鵝湖、草食動(dòng)物散養(yǎng)區(qū)、獅虎山和草食區(qū)共5個(gè)片區(qū)進(jìn)行分析。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率與同區(qū)域流浪貓弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率成正比(R2=0.978，P<0.001)，說(shuō)明野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染率與館舍附近流浪貓弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率呈正相關(guān)。

3 討論

弓形蟲(chóng)病的癥狀、病理變化雖有一定的特征，但必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，查出病原體或其特異性抗體方能確診[3]。目前，群體動(dòng)物感染弓形蟲(chóng)的情況主要通過(guò)抗體測(cè)試進(jìn)行判斷[4]。改良凝集試驗(yàn)(MAT) 是由美國(guó)學(xué)者Dubey等在直接凝集試驗(yàn)基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)改良而建立的檢測(cè)方法，Dubey將幾種免疫診斷技術(shù)比較后確認(rèn)了MAT法是弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[1]，因此，本調(diào)查選定了MAT檢測(cè)法開(kāi)展研究。本調(diào)查選取的珍稀野生動(dòng)物和流浪貓均無(wú)接種弓形蟲(chóng)疫苗史，血清中弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性說(shuō)明其感染過(guò)弓形蟲(chóng)。

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，臨沂動(dòng)植物園園區(qū)內(nèi)181頭(只)珍稀野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)IgG抗體總體陽(yáng)性率為38.12%，而北京、上海、成都、杭州和福州動(dòng)物園的弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率分別為19.35%、35.00%、47.46%、21.19%和22.70%[5-9]，說(shuō)明魯南蘇北地區(qū)野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染率較高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于北京、杭州和福州等地。本園中頻繁發(fā)生的斑馬、梅花鹿等流產(chǎn)，不能排除與弓形蟲(chóng)病有關(guān)，后續(xù)將進(jìn)一步有目的性地鑒別診斷。同群野生動(dòng)物中冬季的弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率明顯高于夏季，這可能與弓形蟲(chóng)卵囊對(duì)高溫和紫外線敏感，卵囊在夏季孢子化率下降有關(guān)。與北京、上海、福州等地動(dòng)物園[5-6,9]情況一致的是，臨沂動(dòng)植物園內(nèi)野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染率與館舍的開(kāi)放度也有很大關(guān)聯(lián)性，這主要是因?yàn)榘腴_(kāi)放性館舍中，小型動(dòng)物流浪貓、老鼠等可自由出入，其排泄物包含有弓形蟲(chóng)卵囊[10]，可能對(duì)動(dòng)物飼料及環(huán)境造成潛在的威脅，從而導(dǎo)致草食類和鳥(niǎo)類動(dòng)物弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率明顯高于肉食類動(dòng)物。動(dòng)物采食被污染的飼料是感染弓形蟲(chóng)的一個(gè)重要途徑[11]，本次調(diào)查中，在哺乳動(dòng)物中，食肉性動(dòng)物弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率明顯低于植食性動(dòng)物和雜食性動(dòng)物。分析這一現(xiàn)象可能原因：首先是植食性和雜食性動(dòng)物居住館舍比較封閉，流浪貓不能進(jìn)入，降低了感染的概率；其次是肉類和魚(yú)類飼料全部經(jīng)過(guò)科學(xué)冷凍后再解凍投喂，冷凍后飼料中的弓形蟲(chóng)卵囊存活率降低，極大地減少了感染的概率；另外，雜食性鳥(niǎo)類可采食地面昆蟲(chóng)或者蚯蚓之類的小動(dòng)物，導(dǎo)致誤吞入弓形蟲(chóng)而發(fā)生了感染。

本次調(diào)查中，雄性流浪貓弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率為21.42%，雌性流浪貓陽(yáng)性率為23.08%，二者差異不顯著(x2=0.906，P>0.05)，此結(jié)果與于晉海等[12]研究結(jié)果一致。本調(diào)查中不同季節(jié)流浪貓弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率差異顯著(P<0.05)，這可能與環(huán)境溫度影響弓形蟲(chóng)卵囊的存活率有關(guān)。流浪貓與園區(qū)其他動(dòng)物間接接觸途徑主要包括：弓形蟲(chóng)陽(yáng)性流浪貓排出卵囊污染館舍、飼料、水源等，被動(dòng)物接觸或誤食后感染；在爭(zhēng)奪食物過(guò)程中發(fā)生肢體接觸；流浪貓將弓形蟲(chóng)傳染給鼠類，部分動(dòng)物捕食老鼠后感染。本調(diào)查與趙娟等[5]研究結(jié)果一致，野生動(dòng)物與館舍及周邊流浪貓感染弓形蟲(chóng)的趨勢(shì)一致，野生動(dòng)物弓形蟲(chóng)總體感染率與館舍附近流浪貓弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率呈正相關(guān)。

本次調(diào)查說(shuō)明，圈養(yǎng)野生動(dòng)物中也存在較高的弓形蟲(chóng)感染率，加強(qiáng)對(duì)飼料、環(huán)境、從業(yè)人員的科學(xué)管理，不僅是保護(hù)珍稀野生動(dòng)物的需要，更是減少人和多種動(dòng)物弓形蟲(chóng)病互患風(fēng)險(xiǎn)的有效措施。