李博文 韓元圣 黃高俊 鄭磊

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球第3大多發(fā)性腫瘤，也是第2大癌癥死亡病因[1-2]。目前，結(jié)直腸癌的臨床治療仍以手術(shù)為主，放療、化療為輔。發(fā)病早期多無明顯癥狀，多數(shù)病人確診時(shí)已是晚期，導(dǎo)致預(yù)后較差。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種診斷、治療及與結(jié)直腸癌病理發(fā)展相關(guān)的非編碼小RNA[3]。在眾多miRNA中，miR-370-3p位于人類14號(hào)染色體，參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌、膀胱癌、卵巢癌、膽管癌等多種腫瘤發(fā)病過程[4]。Shen等[5]研究結(jié)果顯示，miR-370在結(jié)直腸癌病人癌組織中下調(diào)表達(dá)，并抑制癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡。Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)是炎癥、先天免疫、傳染病及炎癥介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生的主要成分[6]。TLR4是TLR家族的關(guān)鍵成員，也是炎癥反應(yīng)的重要因子。研究表明，多種腫瘤中均檢測(cè)到TLR4的異常高表達(dá)，并且參與調(diào)控癌細(xì)胞增殖、侵襲等過程[7]。此外，miR-370-3p還能夠調(diào)控炎癥相關(guān)信號(hào)通路，降低IL-6、IL-1β、TLR4等炎癥因子的表達(dá)[8]。Zhang等[8]研究表明，在急性期肺炎病人血清TLR4表達(dá)上調(diào)，miR-370-3p表達(dá)下調(diào)，兩者呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TLR4是miR-370-3p的靶基因。本研究檢測(cè)miR-370-3p、TLR4在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平，并分析其臨床意義。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2016年1月～2018年6月在本院肛腸外科行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌病人146例，術(shù)中收集切除的癌組織標(biāo)本及癌旁組織(距癌組織超過5 cm)。男79例，女67例，年齡<60歲62例， ≥60歲84例，TNM期中81例Ⅰ+Ⅱ期、65例Ⅲ+Ⅳ期。所有研究對(duì)象均屬于首次確診原發(fā)性結(jié)直腸癌，且術(shù)后病理檢查證實(shí)為結(jié)直腸癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后失訪；伴有其他惡性腫瘤；入院前有放療、化療史；有全身感染性疾??；合并有結(jié)腸穿孔、腸道結(jié)核等腸道部位疾病。術(shù)后隨訪3年，每6個(gè)月固定以電話或病人就醫(yī)復(fù)診形式進(jìn)行，時(shí)間截止至2021年6月。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)，研究對(duì)象自愿參加。

二、方法

1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 檢測(cè)miR-370-3p和TLR4表達(dá)水平：從-80 ℃取出組織標(biāo)本，經(jīng)研磨后使用試劑盒提取總RNA，然后在微量核酸分析儀上測(cè)定RNA質(zhì)量；使用PrimeScript RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；使用SYBR Green染料在ExicyclerTM 96實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)采集信號(hào)。miR-370-3p以U6為內(nèi)參，TLR4以β-actin為內(nèi)參，所有序列均送至上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，引物具體序列及來源均列于表1。采用2-△△Ct法計(jì)算表達(dá)量。

表1 引物序列

2.免疫組化法檢測(cè)TLR4蛋白表達(dá)水平：取石蠟包埋的組織切成5 μm厚的切片，二甲苯脫蠟后，酒精水化；加熱收回抗原，然后逐步加入3% H2O2，山羊血清封閉；加入TLR4一抗過夜孵育；加山羊抗兔IgG二抗再次孵育；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。由兩名研究人員對(duì)免疫染色進(jìn)行評(píng)分，TLR4蛋白顯色于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。具體評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)見表2。最后根據(jù)評(píng)分結(jié)果分為低表達(dá)組(≤4分)、高表達(dá)組(≥5分)。

表2 染色評(píng)分表

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

1.miR-370-3p和TLR4 mRNA表達(dá)水平：結(jié)直腸癌組織中miR-370-3p表達(dá)水平低于癌旁組織；TLR4在癌組織中的mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 miR-370-3p和TLR4表達(dá)水平比較

2.TLR4蛋白表達(dá)水平比較：TLR4在結(jié)直腸癌組織中的高表達(dá)率為40.41%，在癌旁組織中高表達(dá)率為13.01%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 TLR4在各組織中免疫組化染色情況(蘇木素染色 ×400)

3.癌組織中miR-370-3p、TLR4表達(dá)水平與結(jié)直腸癌病人臨床病理特征分析：以癌組織中miR-370-3p表達(dá)水平平均值為界限，將結(jié)直腸癌病人分為miR-370-3p高表達(dá)組(82例)和低表達(dá)組(64例)；TLR4的免疫組化結(jié)果顯示，其高表達(dá)組為59例，低表達(dá)組為87例。miR-370-3p、TLR4不同表達(dá)水平與病人脈管浸潤、年齡、性別、腫瘤部位、神經(jīng)浸潤、腫瘤直徑無顯著相關(guān)性(P>0.05)，與TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在差異(P<0.05)。見表4。

表4 miR-370-3p、TLR4表達(dá)水平與病人臨床病理特征的關(guān)系比較(例)

4.miR-370-3p與TLR4的相關(guān)性分析：Targetscan預(yù)測(cè)顯示miR-370-3p與TLR4存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖2。Pearson分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中miR-370-3p與TLR4呈負(fù)相關(guān)(r=-0.760，P=0.000)。見圖3。

圖2 miR-370-3p序列中含有與TLR4互補(bǔ)的核苷酸序列

圖3 miR-370-3p與TLR4的相關(guān)性分析

5.結(jié)直腸癌病人預(yù)后不良多因素Cox回歸分析：以單因素分析中有差異的miR-370-3p、TLR4、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為自變量，以結(jié)直腸癌病人預(yù)后不良作因變量進(jìn)行Cox回歸分析，結(jié)果顯示miR-370-3p、TNM分期、分化程度、TLR4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是影響預(yù)后的因素(P<0.05)。見表5。

表5 Cox回歸分析影響病人預(yù)后的因素

6.miR-370-3p、TLR4表達(dá)水平與病人生存時(shí)間的關(guān)系：所有病人術(shù)后隨訪3年，146例病人中95例存活，51例死亡，總生存率為65.07%。miR-370-3p高表達(dá)組病人的3年累積生存率(78.05%)顯著高于miR-370-3p低表達(dá)組(48.44%)(Log-rank χ2=14.309，P=0.000)。TLR4低表達(dá)組累積生存率為73.56%高于TLR4高表達(dá)組(52.54%)(Log-rank χ2=6.765，P=0.009)。見圖4。

圖4 miR-370-3p、TLR4表達(dá)水平與病人生存時(shí)間的關(guān)系

討論

結(jié)直腸癌約占全球癌癥死亡人數(shù)的10%，其中女性病人的發(fā)病率及死亡率比男性低25%[11]。病理早期的病人預(yù)后效果較好，隨著病情加重，晚期病人的預(yù)后較差。如果發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，將會(huì)進(jìn)一步損害消化系統(tǒng)、骨骼、肺、肝、淋巴等[11-12]。結(jié)直腸癌是一種多因素癌癥，使用結(jié)腸鏡檢查進(jìn)行的早期篩查和對(duì)分子機(jī)制的了解有助于降低其發(fā)生率和死亡率。針對(duì)血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)的抗體已應(yīng)用于臨床治療，尋找與結(jié)直腸癌有關(guān)的分子標(biāo)志物對(duì)改善預(yù)后至關(guān)重要[13]。

miRNA在腫瘤細(xì)胞分化中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。多項(xiàng)研究表明，miR-370-3p參與膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌、膽管癌、卵巢癌等腫瘤發(fā)病過程[4]。Shen等[5]的結(jié)果顯示，miR-370在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，并且miR-370的表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，通過抑制癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡在結(jié)直腸癌中起抑癌作用。在膀胱癌中miR-370表達(dá)下調(diào)，并與腫瘤惡性轉(zhuǎn)化高度相關(guān)，過表達(dá)miR-370能有效阻止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，miR-370通過靶向SOX12對(duì)膀胱癌產(chǎn)生抑制作用[14]。本研究結(jié)果表明，與癌旁組織相比，miR-370-3p在癌組織表達(dá)水平降低，并與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在明顯相關(guān)性，說明miR-370-3p可反映病情嚴(yán)重程度，與結(jié)直腸癌進(jìn)展密切相關(guān)。

TLR是一類在免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞中表達(dá)的模式識(shí)別受體，能引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，釋放炎性介質(zhì)，并在免疫反應(yīng)中起著重要作用。有研究證實(shí)，腫瘤周圍的炎性反應(yīng)也是促進(jìn)腫瘤發(fā)展的必要因素[15]。一項(xiàng)Meta分析結(jié)果顯示，TLR3、TLR4、TLR9的高表達(dá)與腫瘤病人預(yù)后相關(guān)，TLR3高表達(dá)與病人預(yù)后良好相關(guān)，TLR4高表達(dá)與晚期病人預(yù)后不良有關(guān)，而TLR9與早期腫瘤病人的預(yù)后不良有關(guān)[16]。其中，TLR4定位于人17號(hào)染色體，不僅能促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，還能誘導(dǎo)細(xì)胞分化、增殖，并且能通過多種途徑參與調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展。TLR4表達(dá)上調(diào)與前列腺癌較高的復(fù)發(fā)率、乳腺癌的腫瘤大小和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、卵巢癌病人較低的生存率有關(guān)[17]。楊湘等[18]在喉癌組織中檢測(cè)到TLR4高表達(dá)，其表達(dá)水平與臨床分期、浸潤程度、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Beilmann-Lehtonen等[17]的免疫組化結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌組織中TLR4高表達(dá)與病人較差預(yù)后相關(guān)。結(jié)合本研究結(jié)直腸癌組織中TLR4 mRNA及蛋白水平均上升，進(jìn)一步證實(shí)了TLR4在結(jié)直腸癌中的高表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)，TLR4表達(dá)水平與TNM分期、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度相關(guān)，說明TLR4參與結(jié)直腸癌發(fā)展過程。

此外，miRNA也是體內(nèi)炎癥信號(hào)的重要調(diào)節(jié)劑，并參與人類多種炎癥疾病過程。Lin等[4]在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，miR-370-3p通過靶向TLR4和β-catenin對(duì)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，降低了小鼠的死亡率和腫瘤發(fā)生。Tian等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-370-3p通過靶向TLR4來減少炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化。本研究結(jié)果表明，癌組織中miR-370-3p與TLR4呈負(fù)相關(guān)，提示miR-370-3p、TLR4共同參與了結(jié)直腸癌病理過程，但其中的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究的Cox分析結(jié)果顯示，miR-370-3p、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TLR4、分化程度均是影響結(jié)直腸癌病人預(yù)后的因素(P<0.05)。生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，miR-370-3p高表達(dá)、TLR4低表達(dá)的病人3年累積生存率分別顯著高于miR-370-3p低表達(dá)、TLR4高表達(dá)病人，說明miR-370-3p表達(dá)水平高、TLR4表達(dá)水平低時(shí)結(jié)直腸癌病人預(yù)后較好。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中miR-370-3p低表達(dá)、TLR4高表達(dá)，miR-370-3p與TLR4呈負(fù)相關(guān)性，二者表達(dá)水平均可影響病人預(yù)后。當(dāng)miR-370-3p高表達(dá)、TLR4低表達(dá)時(shí)病人累積生存率較高。本研究納入的樣本量有限，研究對(duì)象存在地域、生活環(huán)境等的局限性，后期將擴(kuò)大樣本繼續(xù)研究影響預(yù)后的因素以及miR-370-3p與TLR4調(diào)控結(jié)直腸癌發(fā)病的具體機(jī)制。