彭啟旺 鄧浩 李威

胃癌起病隱匿，多數(shù)病人確診時已處于中晚期[1-2]。晚期胃癌常出現(xiàn)侵襲或轉(zhuǎn)移，即使行胃癌根治性切除術(shù)，也存在較高死亡風(fēng)險[3]。早期識別胃癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的高風(fēng)險病人并制定個性化治療方案，對延長病人的生存時間具重要意義。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)與胰腺癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤相關(guān)[4]。LncRNA通過調(diào)控染色體結(jié)構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、蛋白質(zhì)活性等等過程參與腫瘤的進展[5]。有研究表明，胃癌LncRNA通過募集 WDR5/KAT2A 復(fù)合物作為胃癌“支架”刺激腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[6]，LncRNAs的異常表達可能間接反映胃癌的發(fā)生發(fā)展?；蛲ǔ２粫为氉饔?，因此有必要選擇合適的LncRNA并建立多LncRNA預(yù)測模型，為評估胃癌早期復(fù)發(fā)提供指導(dǎo)。本研究分析胃癌病人術(shù)后早期復(fù)發(fā)相關(guān)LncRNA，構(gòu)建基于LncRNA表達的胃癌病人術(shù)后早期復(fù)發(fā)的預(yù)測模型。

對象與方法

一、對象

2016年6月～2019年1月我院行胃癌切除術(shù)的病人121例。納入標準：(1)病理檢查確診胃癌并行胃切除術(shù)和D2淋巴結(jié)清掃術(shù)[7]；(2)病人未進行術(shù)前化療或放療；(3)腫瘤分化為中、高分化；(4)病人或其家屬知曉本研究并簽署知情同意書。排除標準：合并其他部位惡性腫瘤；合并嚴重基礎(chǔ)疾病，如心肺功能不全等；TNM分期≥Ⅲ期。剔除標準：術(shù)后半年內(nèi)死亡；個人原因不能配合全程隨訪。本研究經(jīng)過醫(yī)學(xué)倫理委員會審查。

二、方法

1.LncRNA 表達檢測：采用實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Invit rogen公司，胎牛血清購于美國Gibco公司，TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ 及PrimeScriptTM RT Master Mix購于日本Takara公司，LipofectamineTM 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒購于美國 Invitrogen 公司。

2.資料收集：收集病人一般資料，包括年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，疾病分期、腫瘤最大徑、腫瘤位置，術(shù)后化療情況等。

3.隨訪：隨訪病人復(fù)發(fā)情況。通過組織病理學(xué)檢查確認病人是否復(fù)發(fā)。術(shù)后隨訪2年，共失訪21例，最終納入100例病人，其中31例病人出現(xiàn)復(fù)發(fā)為復(fù)發(fā)組，69例未復(fù)發(fā)的病人為未復(fù)發(fā)組。兩組病人年齡、性別、臨床特征等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組病人臨床資料分析

三、統(tǒng)計分析和數(shù)據(jù)預(yù)處理

結(jié)果

1.異基因篩選及胃癌病人術(shù)后早期復(fù)發(fā)的風(fēng)險因素分析：在胃癌術(shù)后病人中，edgeR 共篩選出992個DEL，其中772個上調(diào)，220個下調(diào)，單變量分析顯示，復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組63 個 LncRNA 表達存在差異；Lasso-COX 回歸模型分析顯示，22個 LncRNA 是胃癌病人術(shù)后早期復(fù)發(fā)的風(fēng)險因素；將22個 LncRNA 進一步納入多變量 COX 回歸分析中顯示，AC007991.4、AC079385.3和AL109615.2是胃癌病人術(shù)后早期復(fù)發(fā)的強風(fēng)險因素，見圖1、2、3。

圖1 紅色表示上調(diào)的 LncRNA；綠色表示下調(diào)的 LncRNA

圖2 通過十倍交叉驗證法調(diào)節(jié)參數(shù)λ將模型中二項式偏差降到最小后篩選出的效能較好的特征集合

圖3 森林圖顯示AC007991.4、AC079385.3和AL109615.2是胃癌病人術(shù)后早期復(fù)發(fā)的風(fēng)險因素

2.驗證集預(yù)測模型分析：繪制ROC曲線，AC007991.4、AC079385.3、AL109615.2及三者聯(lián)合預(yù)測胃癌病人術(shù)后早期復(fù)發(fā)的效能均較高，見圖4、表2。

圖4 胃癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的ROC曲線

表2 預(yù)測模型ROC曲線參數(shù)

討論

胃癌早期癥狀不明顯，多數(shù)病人在確診時已是晚期，5年總體生存率低于25%[8]。開發(fā)一種可應(yīng)用于臨床風(fēng)險評估的預(yù)后分層系統(tǒng)，對于胃癌病人的治療和隨訪具有重要意義。LncRNA 是一類與基因表達調(diào)控功能相關(guān)的分子[9]。隨著LncRNA功能研究深入，越來越多的證據(jù)表明部分LncRNA在胃癌中異常表達并參與癌癥進展調(diào)控。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)，MAFG-AS1促進胃癌細胞增殖和侵襲，可能是一種有價值的預(yù)后生物標志物；Cai等[11]研究表明，LncRNA pcsk2-2可作為胃癌診斷的生物標志物。然而，這些研究僅討論了單一生物標志物的預(yù)測價值，但基因通常不會單獨作用。因此，需要選擇合適的LncRNA并建立多LncRNA預(yù)測模型。本研究納入121例病人，評估LncRNAs的表達與胃癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)間的相關(guān)性。

本研究通過TCGA 獲得的RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，在胃癌病人中共篩選出992個DEL，其中772個上調(diào)，220個下調(diào)；其中共63個LncRNA與胃癌病人術(shù)后早期復(fù)發(fā)的風(fēng)險相關(guān)；Lasso-COX回歸及多變量COX進一步分析顯示，AC007991.4、AC079385.3和AL109615.2是胃癌病人術(shù)后早期復(fù)發(fā)的獨立風(fēng)險因素，繪制ROC曲線顯示其預(yù)測效能較高，可用于臨床胃癌病人術(shù)后早期復(fù)發(fā)的早期預(yù)測。有研究認為，LncRNA在胃癌中異常表達，且其功能復(fù)雜。作為“支架”，可刺激蛋白質(zhì)之間的相互作用[12]；作為“向?qū)А?，LncRNA 能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)和基因的混合[13]；作為“增強子”，LncRNA 控制基因的轉(zhuǎn)錄，作為“誘餌”，LncRNA 與 microRNA 或蛋白質(zhì)結(jié)合參與癌癥進展調(diào)控[14]。AC007991.4、AC079385.3和AL109615.2三種LncRNA在胃癌組織和細胞中的表達，AC007991.4在胃癌中弱表達，AC079385.3和AL109615.2都是潛在的onco-LncRNA。其中AC007991.4和AC079385.3都是反義LncRNA，位于8號染色體：39918076-39920890和12號染色體：106714924-106733066。目前關(guān)于AC007991.4和AC079385.3的分子功尚無完全明了。AL109615.2作為一種長基因間非編碼RNA，位于6號染色體:44058792-44089288，可競爭性結(jié)合miR-133b與血管內(nèi)皮生長因子C誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)移[15]。同時，在本研究中，為提高模型的預(yù)測準確性，以P<0.05和|logFC|≥1.5作為獲得DEL的截止點，應(yīng)用Lasso和COX回歸分析來分析LncRNA的表達與胃癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性。與以往研究相比，本研究有效地最小化了由單變量COX回歸引起的過擬合。與傳統(tǒng)模型相比，Lasso回歸評估過程包括與回歸嶺的關(guān)系、最佳子集選擇、套索系數(shù)估計之間的聯(lián)系和軟閾值，通過變量選擇和正則化提高了預(yù)測精度和可解釋性。

綜上所述，AC007991.4、AC079385.3和AL109615.2是影響胃癌術(shù)后病人早期復(fù)發(fā)的因素，構(gòu)建風(fēng)險預(yù)測模型，可以指導(dǎo)重點人群檢測，盡可能延長病人生存時間。本研究的不足之處在于納入的樣本量較少，且僅為我院胃癌病人，而基因表達常具人種差異，因此普遍性受限。隨訪時間為2年，隨訪時間較短，研究結(jié)果可能存在偏倚。后期需擴大樣本納入范圍，延長隨訪時間。