吳玉婷，謝超，周卓穎，李遠(yuǎn)慧，朱亞猛，史恬恬，王益男

（1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.浙江馳力科技股份有限公司，浙江 舟山 316000）

鮸魚屬鱸形目石首魚科，通體銀灰色，常被稱作米魚。這種魚類主要生活在溫暖的水域，是底層洄游性魚類。舟山東海中鮸魚分布較多捕獲量巨大，資源豐富。研究發(fā)現(xiàn)，鮸魚有食補(bǔ)效果，具有補(bǔ)血、消炎、潤肺等作用。鮸魚肉是一種高蛋白低脂的肉類，且含有20種以上的不飽和脂肪酸，其中，棕櫚油酸、丁酸、油酸含量較高。除此之外，鮸魚肉中含有幾種對(duì)人體有益的微量元素，其中K、Mg、Ca含量較多。因此鮸魚具有極高的營養(yǎng)價(jià)值，既適合減脂健身的人群，還有益于缺鐵性貧血和肝臟有炎癥的人群?，F(xiàn)階段對(duì)鮸魚多采用冷藏、冰塊保鮮的簡單處理，魚肉品質(zhì)判斷的一個(gè)重要指標(biāo)是生物胺的產(chǎn)生狀況，目前關(guān)于鮸魚中生物胺的研究較少。

生物胺由氨基酸脫羧而成，一般分為脂肪族、芳香族和雜環(huán)類胺，也可分為單胺和多胺類。常見的組胺和色胺屬于單胺類物質(zhì)，而尸胺和腐胺為多胺類物質(zhì)。過量生物胺的攝入會(huì)使人中毒，情況較輕的產(chǎn)生頭痛、嘔吐等，情況嚴(yán)重的可能引起神經(jīng)毒性。所以，對(duì)魚類貯運(yùn)過程中生物胺的形成及含量進(jìn)行研究是有必要的。

該研究以舟山鮸魚作為試驗(yàn)材料，探究25℃和4℃條件下鮸魚品質(zhì)及生物胺的變化，包括pH值、菌落總數(shù)（total bacterial count，TVC）、滴水損失率、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）和幾種常見生物胺含量變化趨勢(shì)以及生物胺在魚肉中的分布規(guī)律，以期為鮸魚等水產(chǎn)品中生物胺形成機(jī)理的深入研究及如何控制生物胺從而延長鮸魚保藏期提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鮸魚：舟山市普陀昌津水產(chǎn)有限公司。

丙酮、氧化鎂（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（分析純）：以達(dá)科技（泉州）有限公司；硼酸（分析純）：吉安市豪邁精細(xì)化工實(shí)業(yè)有限公司；氯化鈉（分析純）：上海博微生物科技有限公司；腐胺、尸胺、酪胺、組胺、丹黃酰氯（均為色譜純）：美國sigma公司；正己烷、乙醚、正丁醇、氯仿、谷氨酸鈉、三氯乙酸、氫氧化鈉（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、丙酮（均為色譜純）：美國Fisher Chomical公司。

從鮸魚背部切取5 cm×3 cm×2 cm的長方塊肉，將所有的方塊肉平均分成對(duì)照組和試驗(yàn)組。對(duì)照組：75%酒精涂抹表面來減少魚表面細(xì)菌；試驗(yàn)組：不做特殊處理。魚塊按照在魚身的位置分為3個(gè)部分，最外層標(biāo)記為外；中間層記為中；最里層則記為內(nèi)。在指標(biāo)測(cè)定試驗(yàn)中，選取同一區(qū)域的魚肉，大小同上述，一組在4℃貯藏12 d，另一組在25℃中貯藏24 h。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（LC-2030）：日本島津公司；高速均質(zhì)器（FSH-2A）：上海帥登儀器有限公司；針頭微孔濾膜過濾器（0.22 μm）：上海佩歐生物科技有限公司；pH計(jì)（PHS-3E）；上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-IFD型）：廣東省醫(yī)療器械廠；色譜柱（SB-C18，250 mm×4.6 mm，孔徑 100 ?，粒徑 5 μm）：安捷倫儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

參考郭慧等、韓笑的丹黃酰氯衍生法處理樣品。取5.00 g不同部位魚肉泥，加入15 mL10%三氯乙酸溶液，充分振蕩，5 000 r/min離心10 min，取上清液用三氯乙酸稀釋至50 mL。取10 mL上述所得濾液，加入氯化鈉至飽和，再加入5 mL正己烷，振蕩5 min，靜置。取下層溶液用NaOH將pH值調(diào)至12.0，吸取5 mL溶液后加入同體積正丁醇、氯仿溶液，取上層溶液滴加0.2mL 1mol/L的HCl，加入2mL 0.1mol/L HCl溶液。然后加入1mL 10 mg/mL丹磺酰氯溶液、1 mL飽和NaHCO溶液和0.1 mL 2 mol/LNaOH溶液，60℃水浴0.5 h后加入0.2 mL 50 g/L谷氨酸鈉溶液，繼續(xù)60℃水浴15 min，用氮?dú)獬ケ?，再加?.5 g氯化鈉、1 mL水和3 mL乙醚。取下層溶液加入1 mL乙腈，最后用0.22 μm微孔濾膜針頭濾器，注于進(jìn)樣瓶。生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定方法同上。

1.3.2 pH值的測(cè)定

取3 g絞碎均勻的魚肉，加入30 mL蒸餾水，均質(zhì)后過濾，pH計(jì)直接測(cè)定濾液pH值。

1.3.3 滴水損失率的測(cè)定

取35.0 g魚肉，記為第一次魚肉質(zhì)量。將魚肉置于膨脹的保鮮袋，用塑料線打結(jié)后懸空放在4℃冷藏環(huán)境下至24 h。取出后瀝干測(cè)定第二次魚肉質(zhì)量。滴水損失率計(jì)算公式如下。

式中：w為滴水損失率，%；m為第一次測(cè)定魚肉質(zhì)量，g；m為第二次測(cè)定魚肉質(zhì)量，g。

1.3.4 菌落總數(shù)的測(cè)定

菌落總數(shù)參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)菌落總數(shù)測(cè)定》中的方法測(cè)定。

1.3.5 揮發(fā)性鹽基氮含量的測(cè)定

揮發(fā)性鹽基氮含量參考GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中方法，使用自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定。

1.3.6 生物胺含量的測(cè)定

魚類水產(chǎn)品中得到的生物胺多種多樣，屬尸胺、腐胺、組胺、酪胺較為普遍，這幾種生物胺含量能夠有效體現(xiàn)魚肉新鮮程度且易檢測(cè)，所以試驗(yàn)測(cè)定上述4種生物胺含量變化來判斷魚肉在貯藏期間生物胺產(chǎn)生情況。洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

生物胺含量計(jì)算公式如下。

式中：X為被測(cè)樣品中生物胺的含量，mg/kg；c為進(jìn)樣液中生物胺的含量，mg/L；n為稀釋倍數(shù)；V為被測(cè)樣品溶液體積，mL；m為樣品總質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010與OriginPro 9.1整合各數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 鮸魚肉pH值變化

25℃和4℃貯藏的鮸魚肉pH值變化見圖1。

圖1 25℃和4℃貯藏的鮸魚肉pH值變化Fig.1 pH changes in Miichthys miiuy meat stored at 25℃and 4℃

由圖1可知，魚肉初始pH值為6.64，在25℃貯藏條件下，魚肉pH值整體呈上升趨勢(shì)，先平緩上升再快速上升，然后又出現(xiàn)了平緩的變化最終達(dá)到7.43；在4℃貯藏條件下，魚肉的pH值同樣呈上升趨勢(shì)，在貯藏12 d時(shí)達(dá)7.50。水產(chǎn)品在貯藏過程中會(huì)發(fā)生一些生化反應(yīng)。新鮮鮸魚平均pH值在7.10，在死亡后會(huì)經(jīng)歷僵直、自溶、腐敗3個(gè)階段，期間會(huì)發(fā)生各種生化反應(yīng)，所以魚肉pH值會(huì)不斷發(fā)生變化。在僵直階段，反應(yīng)物腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、磷酸肌酸通過生化反應(yīng)得到的生成物為磷酸，糖酵解得到生成物為乳酸，這些生成物均會(huì)使魚肉酸性增加。在魚體自溶階段，在內(nèi)源性蛋白酶水解蛋白質(zhì)氨基酸等含氮化合物和外源微生物共同作用下，魚體會(huì)產(chǎn)生胺類等堿性物質(zhì)，使魚肉堿性增強(qiáng)。故在鮸魚死后魚肉的pH值應(yīng)呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)，而試驗(yàn)中pH值沒有下降階段，表明魚肉在測(cè)定pH值時(shí)已過僵直期，除此之外，25℃下的魚肉可能是因?yàn)榍捌谟兴嵝晕镔|(zhì)的生成減緩了pH值上升的速度。從pH值變化來看，兩個(gè)溫度貯藏過程中魚肉均經(jīng)歷了自溶到腐敗的過程，其中4℃冷藏可能通過降低微生物活性和酶活來減緩該過程。

2.2 鮸魚肉滴水損失變化

導(dǎo)致魚肉滴水損失變化的原因多種多樣，如環(huán)境酸堿度和酶水解等作用。隨著貯藏時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)在自身酶的作用和微生物的共同作用下發(fā)生水解反應(yīng)，使得魚肉組織結(jié)構(gòu)松散，肌間蛋白截留水分能力下降，自由水含量升高，導(dǎo)致魚肉汁液流失，加速魚肉變質(zhì)。25℃和4℃貯藏的鮸魚肉滴水損失變化見圖2。

圖2 25℃和4℃貯藏的鮸魚肉滴水損失變化Fig.2 Changes in water content of Miichthys miiuy meat stored at 25℃and 4℃

由圖2可知，在貯藏初期，兩個(gè)溫度貯藏條件下酶和微生物共同作用導(dǎo)致魚肉肌肉持水性下降，使得鮸魚魚肉滴水損失率產(chǎn)生較大變化。25℃貯藏24 h后鮸魚肉滴水損失達(dá)到4.83%，而4℃下的魚肉貯藏12 d后滴水損失率達(dá)到4.69%。這說明4℃貯藏能有效延緩魚肉組織結(jié)構(gòu)松散，從而延緩魚肉汁液流失。

2.3 鮸魚肉菌落總數(shù)變化

魚肉中微生物含量可以直觀表明魚肉新鮮程度。25℃和4℃貯藏的鮸魚肉TVC變化見圖3。

圖3 25℃和4℃貯藏的鮸魚肉TVC變化Fig.3 TVC changes in Miichthys miiuy meat stored at 25℃ and 4℃

如圖3所示，在25℃和4℃貯藏條件下鮸魚肉的初始 TVC 分別為 4.57 lg（CFU/g）和 4.49 lg（CFU/g），屬于品質(zhì)狀態(tài)較佳的新鮮魚肉，整個(gè)試驗(yàn)周期中，兩者TVC整體均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，25℃下的魚肉TVC于貯藏終點(diǎn)達(dá)到 7.03lg（CFU/g），而 4℃下的則為 7.11lg（CFU/g）。微生物的生長和繁殖會(huì)分解魚肉中的蛋白質(zhì)，生成氨基酸等小分子物質(zhì)，同時(shí)使得蛋白組織結(jié)構(gòu)松散，試驗(yàn)過程中pH值、滴水損失率和TVC均呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)驗(yàn)證了這一理論。這說明4℃貯藏能有效延緩魚肉中微生物的生長繁殖，延緩微生物對(duì)魚肉的分解利用，從而延緩魚肉品質(zhì)劣變。

2.4 鮸魚肉TVB-N變化

貯藏過程中，細(xì)菌不斷代謝增殖，利用含氮化合物產(chǎn)生大量硫化物和三甲胺，產(chǎn)生的這些物質(zhì)為腐敗氣味的主要來源。25℃和4℃貯藏的鮸魚肉TVB-N變化見圖4。

圖4 25℃和4℃貯藏的鮸魚肉TVB-N變化Fig.4 Changes in TVB-N of Miichthys miiuy meat stored at 25℃and 4℃

由圖4可知，兩個(gè)溫度貯藏期間TVB-N初始分別為10.13mg/100g和10.24mg/100g。新鮮魚的揮發(fā)性鹽基氮一般在30 mg/100 g內(nèi)，而試驗(yàn)對(duì)象初始值明顯小于該值，表明魚處于非常新鮮的范圍。在試驗(yàn)貯藏期末，25℃條件下貯藏24h的TVB-N上升至36.53mg/100g，超過了新鮮魚的TVB-N范圍，而4℃條件下在貯藏9 d時(shí)才超過了30 mg/100 g，達(dá)到31.74 mg/100 g。從兩者對(duì)比結(jié)果來看，低溫環(huán)境通過抑制酶活抑制了微生物生長速度，從而很大程度上降低了TVB-N上升速率。

2.5 生物胺標(biāo)準(zhǔn)樣品回歸方程

生物胺回歸方程以及適用區(qū)域見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程及適用區(qū)域Table 2 Linear regression equation and scope of use

2.6 鮸魚肉中生物胺含量變化

影響水產(chǎn)品生物胺形成量的因素有很多，包括水產(chǎn)品種類、微生物種類和貯藏環(huán)境條件，所以各類水產(chǎn)品在不同溫度條件下貯藏會(huì)產(chǎn)生的生物胺不一。25℃和4℃下鮸魚肉生物胺含量的變化分別見圖5和圖6。

圖5 25℃下鮸魚肉生物胺含量的變化Fig.5 Changes in biogenic amine content in Miichthys miiuy meat at 25℃

圖6 4℃下鮸魚肉生物胺含量的變化Fig.6 Changes in biogenic amine content in Miichthys miiuy meat at 4℃

由圖5可知，在25℃貯藏條件下，4種生物胺均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，整體趨勢(shì)一致，但各增長速率有所不同，尸胺產(chǎn)生速率最快，而腐胺和組胺的產(chǎn)生速率相差不多，酪胺的生成速率最慢。在25℃貯藏條件下，4種生物胺在0～6 h時(shí)含量幾乎為0，12 h后4種生物胺含量明顯增加且出現(xiàn)不同程度的上升，其中增長最快的尸胺含量在24 h時(shí)達(dá)到了35.71 mg/kg，腐胺和組胺最終分別達(dá)到了22.54 mg/kg和21.48 mg/kg。酪胺含量最終僅有9.09 mg/kg。

由圖6可知，在4℃條件下，0～3 d內(nèi)4種生物胺含量少且未出現(xiàn)明顯差別。與25℃貯藏相比，組胺大幅度上升，在12 d時(shí)達(dá)到了41.78 mg/kg，腐胺和尸胺含量的增長速率相差不多，酪胺仍增長最慢，0～12 d中未超過10 mg/kg，最終達(dá)到9.01 mg/kg。魚肉表面微生物生長繁殖過程中利用氨基酸脫羧酶分解魚肉中組氨酸、酪氨酸等氨基酸來產(chǎn)生生物胺，使得魚肉表面生物胺含量大幅上升，隨著貯藏時(shí)間的延長，中間層和內(nèi)層魚肉中的氨基酸也會(huì)被脫羧生成生物胺。而不同種類的細(xì)菌生長繁殖能力和所含的脫羧酶種類不同，因此各類生物胺產(chǎn)生的多少與快慢均有所區(qū)別。從圖5和圖6的趨勢(shì)來看，4℃低溫抑制了微生物生長，使生物胺的產(chǎn)生速率下降。與pH值、TVC值、TVBN和水分含量相結(jié)合分析，魚肉在貯藏初期為較新鮮魚肉，與生物胺含量所表明結(jié)果一致，高水分為微生物提供了合適的生長環(huán)境，因此TVC持續(xù)上升，含氮化合物產(chǎn)生堿性物質(zhì)的生化反應(yīng)隨之增加，所以揮發(fā)性鹽基氮含量和pH值也會(huì)隨之上升。綜上所述，鮸魚肉中生物胺主要源于魚肉表面微生物作用。

2.7 鮸魚肉中生物胺分布情況

25℃貯藏條件下鮸魚各部分生物胺含量見圖7。

圖7 25℃貯藏條件下鮸魚各部分生物胺含量Fig.7 Biogenic amine content of Miichthys miiuy meat at different positions under storage at 25℃

由圖7可知，魚肉從外到內(nèi)，兩組的生物胺含量均呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)。這說明生物胺主要產(chǎn)生于外層，且主要原因并非內(nèi)源酶作用。除此之外，試驗(yàn)組生物胺三層肌肉生物胺含量都明顯大于對(duì)照組。25℃貯藏條件下，試驗(yàn)組生物胺含量從外到內(nèi)依次為90.45、32.20、7.78 mg/kg，而對(duì)照組的生物胺含量分別為12.87、7.44、5.01 mg/kg。

4℃貯藏條件下鮸魚各部位生物胺含量見圖8。

圖8 4℃貯藏條件下鮸魚各部位生物胺含量Fig.8 Biogenic amine content of Miichthys miiuy meat at different positions under storage at 4℃

由圖8可知，4℃貯藏條件下，試驗(yàn)組生物胺含量從外到內(nèi)依次為 101.59、35.32、18.39 mg/kg，而對(duì)照組的生物胺含量分別為26.39、8.10、2.00 mg/kg。對(duì)照組經(jīng)過75%酒精擦拭處理，而試驗(yàn)組是在無特殊處理情況下測(cè)定。

25℃和4℃貯藏條件下的生物胺含量及分布均說明酒精抑制了魚肉表明微生物的生長繁殖，因此可以得出，魚肉中生物胺主要來源于魚表面微生物的生長代謝。楊珊珊等也認(rèn)為大多數(shù)的生物胺是由外源微生物中的氨基酸脫羧酶催化氨基酸等物質(zhì)發(fā)生脫羧等一系列反應(yīng)而產(chǎn)生的，少數(shù)生物胺由內(nèi)源性的脫羧酶催化產(chǎn)生。

3 結(jié)論

研究表明在25℃和4℃貯藏條件下，鮸魚肉pH值、滴水損失率、菌落總數(shù)、TVB-N和生物胺含量均呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)。鮸魚肉的pH值均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，25℃下貯藏24 h上升至7.43，而4℃冷藏條件下貯藏12 d pH值達(dá)到7.50；25℃條件下貯藏終點(diǎn)TVB-N上升至36.53 mg/100 g，超過新鮮魚的TVB-N范圍，而4℃條件下在貯藏9d時(shí)才超過了30 mg/100 g，達(dá)到31.74 mg/100 g。不同溫度下貯藏末期鮸魚肉外層生物胺含量均顯著高于其他部位，結(jié)合酒精擦拭表面試驗(yàn)表明生物胺的產(chǎn)生絕大部分來自于外源微生物的作用。以上研究結(jié)果為水產(chǎn)品中的生物胺產(chǎn)生機(jī)制的深入研究和如何控制生物胺延長鮸魚保藏期奠定了一定的基礎(chǔ)。