周 偉，高 奇，王海燕，呂寶興，李玉琴*

（1. 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院） 藥學(xué)院，山東 泰安 271000；2. 泰安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東 泰安 271016）

尼莫地平（Nimodipine）作為二氫吡啶類 L 型 Ca2+通道阻滯劑，可抑制腦血管細(xì)胞 Ca2+跨膜內(nèi)流，阻止平滑肌的收縮，有效改善血管痙攣問(wèn)題[1-2]。由于尼莫地平的脂溶性較好，可穿過(guò)血腦屏障到達(dá)腦組織[3]，因此臨床上主要用于蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦血管痙攣、高血壓、缺血性腦損傷等疾病的治療[4-5]。近年來(lái)，尼莫地平還常與鹽酸多奈哌齊、奧拉西坦、吡拉西坦等藥物聯(lián)用治療血管性癡呆[6-8]，有一定的治療效果。

高效液相色譜法（HPLC）是尼莫地平含量測(cè)定的常用方法[9-11]，2020 年版《中國(guó)藥典》二部中尼莫地平片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也使用了 HPLC 測(cè)定其含量[12]，但 HPLC 分析時(shí)間長(zhǎng)，有機(jī)溶劑使用量大。而基于 HPLC 的理論發(fā)展的超高效液相色譜法（UPLC）有著小顆粒固定相填料、極低的系統(tǒng)體積和高靈敏的檢測(cè)器，具有分析速度快、溶劑用量小、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。因此，本研究開(kāi)發(fā)了 UPLC-PDA 測(cè)定尼莫地平含量，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，為尼莫地平的含量測(cè)定提供了高效率、低成本的新方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC H-class 超高效液相色譜儀（包含四元溶劑管理器、FTN 樣品管理器和PDA 檢測(cè)器，美國(guó) Waters 公司）；KQ3200 E 型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；SHIMUADZU AUW220D 電子天平（日本島津公司）。

1.2 藥品與試劑

尼莫地平對(duì)照品（純度 98%，批號(hào) C12229356，上海麥克林生化科技有限公司）；尼莫地平片（30 mg/片，批號(hào) 2010194，山東新華制藥股份有限公司）；甲醇（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司）；乙腈（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司）；甲酸（上海麥克林生化科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 尼莫地平對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制

精密稱取尼莫地平對(duì)照品 5 mg，置于 50 mL 棕色量瓶中，加入甲醇適量，超聲溶解，待其冷卻至室溫，以甲醇定容至刻度，搖勻，即得 100 μg·mL-1的尼莫地平對(duì)照品儲(chǔ)備液，于 4 ℃ 下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 供試品溶液的配制

精密稱重 20 片尼莫地平片，其總重為 1.965 g，將其研成細(xì)粉。精密稱取片粉適量（約含尼莫地平 10 mg），置于 50 mL 棕色量瓶中，加入甲醇適量，超聲溶解，待其冷卻至室溫，以甲醇定容至刻度，搖勻，離心（3 000 r·min-1× 15 min）。精密量取 5 mL 上清液, 置于 50 mL 棕色量瓶中，以甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。供試品溶液臨用時(shí)配制，進(jìn)樣前使用 0.22 μm 膜過(guò)濾。

2.2 色譜條件

Waters Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm），0.1% 甲酸-乙腈（40∶60）為流動(dòng)相，流速 0.25 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng) 235 nm，進(jìn)樣量 1 μL，室溫下測(cè)定。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性

分別精密量取甲醇、10 μg·mL-1的尼莫地平對(duì)照品工作液、供試品溶液各 1 μL，照“2.2”色譜條件分析，記錄色譜圖（見(jiàn)圖 1）。由圖 1 可知，甲醇對(duì)尼莫地平的測(cè)定無(wú)干擾，表明該法專屬性良好。

Fig. 1 UPLC chromatograms of methanol, nimodipine reference solution and test solution 圖 1 甲醇、尼莫地平對(duì)照品工作液、供試品溶液的UPLC色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系

以 100 μg·mL-1尼莫地平儲(chǔ)備液為母液，以甲醇為溶劑，制備濃度為 1、2、5、10、25、50、100 μg·mL-1的尼莫地平對(duì)照品線性工作液，照“2.2”色譜條件測(cè)定，記錄尼莫地平峰面積。以尼莫地平濃度（X）對(duì)其峰面積（Y）的回歸方程為 Y = 1.384 4 × 104X - 7.049 4 × 103（r = 0.999 9），尼莫地平在 1～100 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 檢測(cè)限（LOD）與定量限（LOQ）

信噪比（S/N）≈ 3∶1 時(shí)對(duì)照品的濃度為 LOD；S/N ≈ 10∶1 時(shí)對(duì)照品的濃度為 LOQ。測(cè)得基線噪聲的平均峰高約為 19，計(jì)算得 LOD 與 LOQ 理論峰高應(yīng)約為 57 和 190，并進(jìn)行驗(yàn)證。將 1 μg·mL-1的尼莫地平對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，照“2.2”色譜條件測(cè)定，記錄其 S/N，結(jié)果見(jiàn)圖 2。由圖 2 可得，LOD 為 12 ng·mL-1，LOQ 為 40 ng·mL-1，計(jì)算結(jié)果與驗(yàn)證結(jié)果基本一致。

Fig. 2 UPLC chromatograms of LOD and LOQ of nimodipine reference solution 圖 2 尼莫地平對(duì)照品溶液LOD 與 LOQ 的UPLC色譜圖

2.3.4 精密度

分別制備 5、50、100 μg·mL-1的尼莫地平對(duì)照品工作液，照“2.2”色譜條件測(cè)定，每一濃度測(cè)定 6 次，計(jì)算尼莫地平峰面積的 RSD。低、中、高溶液尼莫地平峰面積 RSD 分別為 0.21%、0.16%、0.12%，方法日內(nèi)精密度良好。將上述溶液連續(xù)進(jìn)樣 3 天，每一濃度測(cè)定 6 次，得尼莫地平峰面積的 RSD 分別為 0.13%、0.069%、0.059%，方法日間精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性

精密稱取 6 份尼莫地平片粉（約含尼莫地平 10 mg）適量，照“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備 6份供試品溶液。在“2.2”色譜條件下測(cè)定，測(cè)定尼莫地平峰面積的 RSD。測(cè)得尼莫地平峰面積的RSD 為 0.41%，表明該法具有良好的重復(fù)性。

2.3.6 穩(wěn)定性

供試品溶液于制備后的 0、2、4、6、8、10、12、24 h 照“2.2”色譜條件測(cè)定，測(cè)得尼莫地平峰面積的 RSD 為 0.17%，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收率

精密稱取尼莫地平 25 mg，置于 25 mL 棕色量瓶中，照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備 1 mg·mL-1的尼莫地平對(duì)照品溶液。精密稱取已知含量（約含尼莫地平 2 mg）的片粉 9 份（見(jiàn)表 1），分別置于 9 個(gè) 50 mL 量瓶中，三份一組。按照片粉中尼莫地平含量的 80%、100%、120%，向其精密加入 1 mg·mL-1的尼莫地平對(duì)照品溶液適量，照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。在“2.2”色譜條件下測(cè)定，記錄尼莫地平峰面積，每份供試品溶液測(cè)定 3 次。將所得尼莫地平峰面積帶入線性關(guān)系項(xiàng)下回歸方程中，計(jì)算加樣回收率（見(jiàn)表 1）。表 1 顯示，低、中、高三個(gè)水平的平均回收率分別為 98.24%、99.17%、100.7%，RSD 分別為 2.0%、0.4%、1.4%，表明回收率良好，方法準(zhǔn)確可行。

Table 1 The results of recovery rate of nimodipine in the test sample 表 1 供試品中尼莫地平的加樣回收率結(jié)果

2.3.8 樣品含量測(cè)定

取 3 份尼莫地平片粉（約含尼莫地平 10 mg），精密稱定，照“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備 3 份供試品溶液。在“2.2”色譜條件下測(cè)定，記錄尼莫地平峰面積，每份供試品溶液測(cè)定 3 次。將所得尼莫地平峰面積代入線性關(guān)系項(xiàng)下回歸方程中，計(jì)算尼莫地平的含量（見(jiàn)表 2）。測(cè)得尼莫地平片中尼莫地平標(biāo)示量的百分含量為 97.96%，RSD 為 0.44%，符合 2020 年版《中國(guó)藥典》二部中尼莫地平片標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)為標(biāo)示量的（90.0～110.0）% 的規(guī)定。

Table 2 The results of the determination of nimodipine content in nimodipine tablets 表 2 尼莫地平片中尼莫地平含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

提取 10 μg·mL-1尼莫地平對(duì)照品工作液色譜圖對(duì)應(yīng)的光譜圖，發(fā)現(xiàn)尼莫地平在波長(zhǎng) 235 nm處有 1 個(gè)特征吸收峰。該波長(zhǎng)下色譜圖基線穩(wěn)定，因此選擇 235 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相

分別使用了甲醇-水（70∶30）和乙腈-水（70∶30）作為流動(dòng)相，比較其色譜圖。甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)峰型較寬，對(duì)稱性較差，而使用乙腈-水時(shí)峰形窄，但存在拖尾現(xiàn)象，這是由于尼莫地平在甲醇中的溶解度低于乙腈所致。為了改善峰拖尾現(xiàn)象，比較了乙腈-水（70∶30）和乙腈-0.1%甲酸（70∶30）作為流動(dòng)相的色譜圖，結(jié)果顯示乙腈-0.1% 甲酸為流動(dòng)相時(shí)尼莫地平峰對(duì)稱性良好，拖尾得到了改善。為進(jìn)一步改善峰形，嘗試不同比例的乙腈-0.1% 甲酸，結(jié)果乙腈-0.1% 甲酸比例為 60∶40 時(shí)峰形尖銳美觀，對(duì)稱性較好。因此最終確定流動(dòng)相為乙腈-0.1% 甲酸（60∶40）。

3.3 流速

流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸（60∶40），檢測(cè)波長(zhǎng) 235 nm，精密量取 10 μg·mL-1尼莫地平對(duì)照品工作液 1 μL，分別在 0.1、0.2、0.25 mL·min-1流速下測(cè)定，記錄尼莫地平出峰時(shí)間，分別為6.608、3.355、2.667 min。比較了在上述流速下的峰形，并綜合考慮分析效率，最終確定流速為 0.25 mL·min-1。

3.4 本法的優(yōu)點(diǎn)

2020 年版《中國(guó)藥典》二部中尼莫地平片的含量測(cè)定所使用 HPLC 法流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水（35∶38∶27），而本法流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸（60∶40），流動(dòng)相組成較簡(jiǎn)單。除此之外，本法使用的流速為 0.25 mL·min-1，有機(jī)溶劑的使用量少。使用本法每個(gè)樣品的分析時(shí)間僅為 3 min，分析效率得到了提高。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了快速測(cè)定尼莫地平含量的 UPLC-PDA，本法重復(fù)性強(qiáng)，精密度和準(zhǔn)確度高，具有分析效率高、有機(jī)溶劑使用量少等優(yōu)勢(shì)。使用本法測(cè)得尼莫地平片中尼莫地平含量符合 2020 年版《中國(guó)藥典》二部中尼莫地平片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，因此本法可為尼莫地平片的質(zhì)量控制提供新的技術(shù)。