劉傳輝 ， 韓 楠

(1.商丘市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心 ， 河南 商丘 467000 ； 2.鶴壁市農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 ， 河南 鶴壁 458000)

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer,RA)引起的一種急性、接觸性傳染病，主要感染2～8周齡的雛鴨、雛鵝等水禽動(dòng)物。主要表現(xiàn)為肝周炎、纖維素性心包炎、腦膜炎和氣囊炎病理特點(diǎn)[1]。1982年我國首次分離鑒定出RA[2]，病死率較高。RA在自然界廣泛存在，國際上公認(rèn)RA有21個(gè)血清型，其中1型和2型為優(yōu)勢(shì)血清型，不同血清型之間沒有交叉免疫保護(hù)，不同地區(qū)分離的菌株血清型也不盡相同，存在較大差異[3]。再加上獸醫(yī)臨床治療中抗菌藥物的盲目或者超劑量使用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性非常嚴(yán)重，給該病的預(yù)防和治療造成很大困難。目前，鴨疫里默氏桿菌病是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)、養(yǎng)鵝業(yè)的重要細(xì)菌性傳染病之一。本試驗(yàn)從商丘市某養(yǎng)鴨場(chǎng)病鴨中分離出6株RA，感染病鴨均為15日齡左右，病理剖檢病死鴨均出現(xiàn)纖維素性心包炎、纖維素性肝周炎和脾腫大等相同的病變，并對(duì)6株RA進(jìn)行了生物特性、耐藥性和致病性試驗(yàn)，以期為商丘市鴨疫里默氏桿菌病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 疑似感染RA的15日齡左右病死鴨來自商丘市不同縣(市、區(qū))的養(yǎng)鴨場(chǎng)，剖檢均可見纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎病理特點(diǎn)。采集病死鴨的腦、心臟、肝臟和脾臟等病料，共28份。12只7日齡健康雛鴨，由商丘市綠都生態(tài)養(yǎng)殖有限公司提供。

1.2 主要試劑 巧克力瓊脂培養(yǎng)基、胰酪蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)(TSA)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)、LB培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基，均由商丘市動(dòng)物疫病控制中心實(shí)驗(yàn)室自制。30%甘油保菌液、革蘭染液、瑞氏染液、微量生化鑒定管和藥敏試紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司。鴨疫里默氏桿菌1、2型菌株和標(biāo)準(zhǔn)血清，均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Goldview核酸染料，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。DL2 000 DNA Marker、2×TaqPCR Mix和瓊脂糖，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 細(xì)菌分離與培養(yǎng) 無菌采取病死鴨的腦組織、肝臟、心包積液，分別接種于巧克力瓊脂培養(yǎng)基和TSA培養(yǎng)基，置于燭缸中37 ℃恒溫箱培養(yǎng) 24～48 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況、菌落特征。分別挑取透明、露珠狀、邊緣光滑的菌落在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行傳代純培養(yǎng)，革蘭染色和瑞氏染色，在顯微鏡下觀察菌體染色特性和形態(tài)。

1.4 細(xì)菌生化鑒定 將純化的單個(gè)細(xì)菌菌落接種于葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖、硫化氫、尿素、氧化酶和枸櫞酸鹽等細(xì)菌生化微量鑒定管中，置燭缸內(nèi)37 ℃恒溫培養(yǎng)24 ～48 h，觀察記錄結(jié)果。

1.5 PCR鑒定 無菌吸取1 mL分離菌純培養(yǎng)物，加入100 μL PBS 溶液，經(jīng)過水浴、離心處理后取上清液為 DNA 模板，參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取細(xì)菌總DNA。采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物進(jìn)行分離菌株的PCR擴(kuò)增。上游引物：16S(F)：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG- 3′，下游引物：16S(R)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT- 3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1 450 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)：模板 DNA 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，最后加滅菌ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸 45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。取40 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將目的條帶回收DNA凝膠純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果輸入NCBI網(wǎng)站中，選取參考菌株的16S rRNA 基因序列，拼接后利用MegAlign 軟件對(duì)分離菌進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.6 血清型鑒定 將鑒定為RA的分離菌接種于TSB培養(yǎng)基，待長(zhǎng)出單菌落之后，挑取單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h后，將菌液離心3次，用PBS將菌體重懸，作為RA分離株玻片凝集抗原。參照黃美玲等[4]報(bào)道的平板凝集試驗(yàn)方法，對(duì)分離菌株進(jìn)行血清型鑒定。分別以對(duì)應(yīng)血清型的陽性菌株作為陽性對(duì)照，大腸埃希菌作為陰性對(duì)照、PBS作為空白對(duì)照，鑒定RA血清型。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：菌液與血清混合后3 min內(nèi)不出現(xiàn)顆粒狀凝集者為陰性，出現(xiàn)顆粒狀凝集者為陽性。

1.7 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法(K-B)，挑取單個(gè)純培養(yǎng)菌落接種于TSB(含5%胎牛血清)，37 ℃培養(yǎng)24 h，生理鹽水調(diào)制菌液濃度為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管，然后吸取100 μL菌液均勻涂布在巧克力平板表面，待平板干燥后，無菌取藥敏紙片貼于巧克力瓊脂平板上，37 ℃孵育18～24 h，利用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑。結(jié)果判定參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)發(fā)布的抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(CLSI—2017)。

1.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將12只健康雛鴨隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6只。選取已鑒定的RA分離菌株接種巧克力瓊脂平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，生理鹽水調(diào)制菌液濃度為2.0×108CFU/mL。試驗(yàn)組腿部肌內(nèi)注射RA分離菌液，0.5 mL/只，對(duì)照組腿部肌內(nèi)注射生理鹽水，0.5 mL/只。觀察并記錄雛鴨臨床癥狀。

2 結(jié)果

2.1 分離菌培養(yǎng)特性和形態(tài)特征 從28份病料中分離出6株疑似RA細(xì)菌，分別命名為SQ-RA1、SQ-RA2、SQ-RA3、SQ-RA4、SQ-RA5和SQ-RA6。細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果見圖1，分離株在巧克力平板培養(yǎng)基和TSA瓊脂平板上菌落微隆起、邊緣整齊、透明、呈露珠狀；分離菌革蘭染色鏡檢呈陰性短小桿菌，無芽孢，兩端鈍圓，多數(shù)單個(gè)存在，少數(shù)成對(duì)或鏈狀排列，長(zhǎng)度為(0.2～0.4)μm×(1～5) μm；分離菌瑞氏染色鏡檢，呈菌體兩極濃染。符合鴨疫里默氏桿菌的形態(tài)特征。

圖1 分離菌顯微鏡觀察Fig.1 Microscopic observation of isolated strains A：分離菌在巧克力培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)； B:革蘭染色(400×)A:Colony morphology of isolated strains on chocolate medium； B:Gram staining (400×)

2.2 生化鑒定 6株分離菌均不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和麥芽糖；V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生、甘露醇、硝酸鹽還原和枸櫞酸鹽試驗(yàn)均為陰性；其中2株分離菌對(duì)氧化酶、觸酶和尿素試驗(yàn)均為陽性。根據(jù)細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征和生化特性試驗(yàn)結(jié)果，6株分離菌可初步鑒定為RA。

2.3 PCR鑒定 瓊脂糖凝膠電泳成像結(jié)果顯示，6株分離菌的擴(kuò)增片段大小均在1 450 bp左右(圖2)，與預(yù)期大小相符。測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示，分離菌與NCBI基因庫 BLAST 中的RA參考菌的16S rRNA基因序列同源性為99.4%～100.0%，均高于97.0%。結(jié)合參考文獻(xiàn)[5]的報(bào)道,分離菌的16S rRNA基因序列同源性為97.0%～98.9%時(shí)，可判定為同屬，同源性高于99.0%時(shí)，可判定為同種。因此，PCR鑒定結(jié)果確定6株分離菌均為RA。

圖2 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA geneM:DL-2 000 Marker； 1～6:分離菌株M:DL-2 000 Marker; 1- 6:Isolated strains

2.4 血清型鑒定 經(jīng)鑒定，SQ-RA1、SQ-RA3為血清1型，SQ-RA2、SQ-RA5和SQ-RA6為血清2型，SQ-RA4為未定血清型菌株。

2.5 藥敏試驗(yàn) 6株分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。6株分離菌對(duì)羧芐西林、氨芐西林、慶大霉素、鏈霉素、多西環(huán)素、頭孢氨芐6種藥物高度耐藥，耐藥率均大于80%，對(duì)復(fù)方新諾明、丁胺卡那、卡那霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、恩諾沙星、阿莫西林7種藥物高度敏感。

表1 分離菌株的藥敏試驗(yàn)Table 1 Drug sensitivity test of isolated strains

續(xù)表

2.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 試驗(yàn)組雛鴨在攻毒8 h內(nèi)，部分雛鴨臨床表現(xiàn)精神不振，臥地嗜睡，站立不穩(wěn)；12 h內(nèi)，雛鴨食欲下降或廢絕，眼鼻流出黏性分泌物，腹瀉；24 h內(nèi)，雛鴨表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，角弓反張，雙腿麻痹，走路搖晃，并有5只雛鴨死亡，第3天試驗(yàn)雛鴨全部死亡。剖檢死亡雛鴨可見心包、胸腔積液增多，纖維素性心包炎，肝臟腫大，有纖維性滲出物覆蓋表面，脾臟出現(xiàn)大理石樣花紋，纖維素性氣囊炎等，與鴨疫里默氏桿菌病的病理特征一致。無菌采集心臟、肝臟、脾臟等病料做細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定，結(jié)果分離出與自然分離株相一致的RA。對(duì)照組雛鴨正常，未見上述臨床癥狀。動(dòng)物攻毒試驗(yàn)表明，血清1型、2型和未知型分離菌均有很強(qiáng)的致病性。

3 討論

鴨疫里默桿菌對(duì)鴨、鵝等水禽養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重，其血清型眾多，據(jù)朱曉霞等[6]報(bào)道,我國主要有18個(gè)血清型，其中1～5型血清型分布最為廣泛。不同地區(qū)的RA菌株不同，即便同一地區(qū)的養(yǎng)殖場(chǎng)，血清型種類也有所差別。周英寧等[7]報(bào)道，廣西地區(qū)主要流行株為血清1型和血清2型；陳宏智等[8]調(diào)查河南省信陽地區(qū)鴨疫里默氏桿菌病流行情況，發(fā)現(xiàn)以血清1型、2型和3型為主；王卓昊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，蘇北及周邊地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型為1型和未定型血清型，并且在一定時(shí)期同一地呈現(xiàn)多菌株多血清型流行的特點(diǎn)。本試驗(yàn)通過細(xì)菌分離、生化試驗(yàn)、血清型鑒定和PCR鑒定，從商丘不同地區(qū)養(yǎng)鴨場(chǎng)疑似感染RA的28份病死鴨中成功分離出6株RA菌株，主要血清型分布為血清1型和2型，分離率為21.43%(6/28)，表明商丘地區(qū)RA流行株與以上報(bào)道結(jié)果基本一致。因此，開展RA血清型調(diào)查，摸清當(dāng)?shù)睾蛨?chǎng)內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌株，對(duì)準(zhǔn)確防控鴨疫里默桿菌病具有重要意義。

文獻(xiàn)報(bào)道顯示，通過不同注射途徑感染RA的鴨，其發(fā)病率和死亡率差別較大,其中肌內(nèi)注射發(fā)病率和死亡率均達(dá)到100%，而腹腔、頸部皮下、腳蹼等其他途徑感染RA的發(fā)病率和死亡率相對(duì)較小[10-12]。因此，肌內(nèi)注射是評(píng)價(jià)RA致病力的首選途徑。本試驗(yàn)中的動(dòng)物回歸試驗(yàn)選用肌內(nèi)注射，第3天試驗(yàn)雛鴨全部死亡，證實(shí)了肌內(nèi)注射感染RA，雛鴨的病死率很高，并且血清1型和2型RA致病力很強(qiáng)。

長(zhǎng)期以來，RA的防治依靠抗生素，由于臨床用藥不規(guī)范，盲目用藥，隨意加大劑量，使得RA產(chǎn)生的耐藥性不斷增加，多重耐藥現(xiàn)象也非常普遍，同時(shí)，不同地區(qū)的分離菌株對(duì)抗生素的敏感性存在差別，這給鴨疫里默氏桿菌病的防治帶來很大困難。因此，在選用抗生素之前，應(yīng)先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果選擇敏感的藥物，避免因耐藥性帶來經(jīng)濟(jì)損失。本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，RA分離菌對(duì)羧芐西林、氨芐西林、慶大霉素、鏈霉素、多西環(huán)素、頭孢氨芐6種藥物高度耐藥，對(duì)復(fù)方新諾明、丁胺卡那、卡那霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、恩諾沙星、阿莫西林7種藥物高度敏感，建議選擇敏感藥物作為商丘地區(qū)臨床治療藥物?？茖W(xué)用藥，根據(jù)本地區(qū)、本場(chǎng)的優(yōu)勢(shì)血清型，選擇免疫原性較好的菌株疫苗開展免疫防治，是有效防控該病的重要途徑。