杜海霞 ， 朱平軍 ， 婁福麗 ， 王夢艷

(1.周口職業(yè)技術(shù)學(xué)院 , 河南 周口 466000 ； 2.商水縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 , 河南 周口 466000 ；3.河南省焦作市溫縣農(nóng)林局 , 河南 焦作 454850)

雞沙門菌病是危害雞養(yǎng)殖業(yè)較嚴(yán)重的疾病之一，也是臨床中常見的細(xì)菌性疾病。可感染雞的沙門菌主要有雞白痢沙門菌、鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌等多種血清型，其中雞白痢沙門菌對(duì)幼雛危害較大，其發(fā)病率和死亡率均較高，可引起產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋率下降，該菌可以通過多種途徑傳播，也可垂直傳播給子代，人食用被沙門菌污染的食品，可引發(fā)食物性中毒和食源性疾病，該菌不僅給養(yǎng)雞業(yè)帶來重大損失，同時(shí)也嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全[1-5]。目前，在臨床中雞沙門菌血清型眾多，傳播方式多樣，沒有有效疫苗可以預(yù)防，主要依靠抗菌藥進(jìn)行治療與預(yù)防，隨著抗菌藥物的不合理使用，導(dǎo)致出現(xiàn)耐藥性及藥物殘留等一系列問題，尤其是殘留藥物可以通過多種途徑傳播給人類，對(duì)人類的健康造成潛在的威脅，同時(shí)由于耐藥性的產(chǎn)生，給臨床中沙門菌病的治療帶來更多的困難[6-7]。因此，臨床中應(yīng)該對(duì)雞沙門菌病進(jìn)行凈化，減少該病的發(fā)生與流行，同時(shí)開發(fā)替抗添加劑具有重要的意義。本試驗(yàn)于2017—2019年采集肉種雞場疑似沙門菌病例的組織、死胚和病死雛雞等病料組織572份，進(jìn)行沙門菌分離鑒定并檢測其耐藥性，為該地區(qū)的肉種雞場沙門菌的綜合防控和科學(xué)使用抗菌藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2017—2019年采集焦作地區(qū)肉種雞場中疑似沙門菌病例的組織、死胚和病死雛雞等病料組織572份。

1.2 主要試劑 沙門菌顯色鑒定培養(yǎng)基、蛋白胨水、沙門菌增菌液(TTB)、營養(yǎng)肉湯，均購自上?？道噬锟萍加邢薰?；臨床中常用的16種抗菌藥藥敏紙片，購自杭州華康微生物試劑有限公司；2×TaqMaster Mix，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DL-2 000 DNA Marker，購自北京中科瑞泰科技有限公司；沙門菌生化鑒定試紙條，購自青島海博生物科技有限公司。

1.3 細(xì)菌分離與鑒定 將采集的樣品進(jìn)行無菌處理后，接種于沙門菌增菌液(TTB)，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)8～12 h增菌后，在無菌條件下，取增菌液50 μL均勻接種于沙門菌顯色鑒定培養(yǎng)基，37 ℃恒溫條件下進(jìn)行鑒別培養(yǎng)12～18 h，挑取沙門菌顯色鑒定培養(yǎng)基單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，取純化培養(yǎng)的分離菌株進(jìn)行染色鏡檢觀察其形態(tài)，按照沙門菌生化鑒定試紙條說明書對(duì)分離的純化培養(yǎng)的菌株進(jìn)行生化特性鑒定。

1.4 細(xì)菌PCR鑒定 對(duì)生化鑒定為沙門菌的菌株，采用水煮法提取分離菌株的基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定。根據(jù)GenBank中沙門菌基因序列，參照參考文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)沙門菌保守區(qū)引物invA(F:5′-ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT-3′；R:5′-AGAC-GACTGGTACTGATCGATAAT-3′),引物invA序列由深圳華大基因股份有限公司合成。沙門菌鑒定基因invA引物擴(kuò)增片段的大小為241 bp，以提取的疑似沙門菌株的基因組DNA為模板，用鑒定引物invA進(jìn)行PCR鑒定，挑取PCR檢測陽性的樣品進(jìn)行測序，其測序結(jié)果與GenBank中公布的沙門菌序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.5 藥敏試驗(yàn) 對(duì)臨床中分離獲得的沙門菌，參照美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和結(jié)果判斷[敏感(S)、中介(I)或耐藥(R)],并分析分離菌株的耐藥性。

1.6 耐藥基因檢測 根據(jù)GenBank中公布沙門菌的耐藥基因序列，參照參考文獻(xiàn)[9-10]，用Primer 5.0設(shè)計(jì)耐藥基因引物，并由深圳華大基因股份有限公司合成。檢測的耐藥基因包括：β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(tem、cmy、shv)，磺胺類耐藥基因(Sul1、Sul2、Sul3)，氨基糖苷類耐藥基因[aac(3)-Iv、aac(6′)-Ib]，喹諾酮類耐藥基因(gyrA、gyrB、qurS)，四環(huán)素類耐藥基因(TetA、TetM、TetR)，酰胺醇類耐藥基因(floR)，多肽類耐藥基因(mcr-1)。以1.4中提取的基因組DNA為模板對(duì)上述7類耐藥基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離與鑒定 在死胚和病死雛雞等病料組織分離得到的菌株，在沙門菌顯色鑒別培養(yǎng)基上長出大小一致、邊緣整齊、藍(lán)紫色的圓形菌落；對(duì)疑似沙門菌的菌株進(jìn)行染色鏡檢，可見分離菌株呈現(xiàn)無莢膜、兩端鈍圓的陰性短桿菌；通過生化鑒定，分離的109株細(xì)菌均鑒定為沙門菌。

2.2 細(xì)菌PCR鑒定 用沙門菌鑒定引物invA對(duì)臨床分離的109株疑似沙門菌菌株進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示，從572份病料組織中分離得到109株沙門菌均可擴(kuò)增出大小約為241 bp的目的條帶(圖1)。通過對(duì)菌株測序分析，臨床分離的109株沙門菌測序結(jié)果與GenBank中公布的參考株同源性介于97.9%～99.6%。表明分離的109株細(xì)菌從分子生物水平鑒定為沙門菌。

圖1 細(xì)菌PCR鑒定Fig.1 PCR identification of bacteriaM:DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1:空白對(duì)照； 2～9:分離菌株M:DL-2 000 DNA Marker; 1:Blank control; 2-9:Isolated strains

2.3 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果如表1所示，分離的109株沙門菌對(duì)阿莫西林、氨芐西林、慶大霉素、新霉素、大觀霉素、多西環(huán)素、土霉素、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺噁唑啉、氟苯尼考、多黏菌素共12種抗菌藥耐藥性較嚴(yán)重，耐藥率介于51.4%～100.0%；對(duì)頭孢噻呋、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星4種藥物耐藥率較低，耐藥率介于11.0%～38.5%。由表2可知，臨床分離的109株沙門菌呈現(xiàn)多重耐藥性，分離菌株以耐12、11、10種藥物最多，分別占分離菌株總數(shù)的16.5%、17.4%和15.6%，說明該地區(qū)分離的沙門菌耐藥性嚴(yán)重。

表1 耐藥性檢測結(jié)果Table 1 Results of drug resistance test (n=109)

表2 多重耐藥性檢測結(jié)果Table 2 Results of multidrug resistance test

2.4 耐藥基因檢測 采用PCR方法對(duì)臨床中分離的109株沙門菌進(jìn)行16種耐藥基因檢測。結(jié)果如表3所示，分離的109株沙門菌攜帶多種基因，其攜帶的耐藥基因Sul1、Sul2、Sul3、aac(3)-Iv、aac(6′)-Ib、TetA、TetM、TetR、floR、mcr-1檢出率介于51.4%～93.5%；耐藥基因tem、cmy、shv、gyrA、gyrB、qurS檢出率介于2.8%～33.0%。

表3 耐藥基因檢測結(jié)果Table 3 Results of drug resistance gene detection (n=109)

3 討論

禽類是沙門菌的攜帶者、傳播者及主要的感染宿主，沙門菌可以在不同禽類養(yǎng)殖過程中廣泛傳播，且傳播方式多樣，既能水平傳播，又能垂直傳播，尤其是種雞(種母雞)攜帶的沙門菌可通過卵傳播給下一代，也可以通過其他途徑傳染給其他健康雞，導(dǎo)致沙門菌在禽類養(yǎng)殖中廣泛流行[2-4]。沙門菌具有多種血清型且具有地區(qū)性，給疫苗研制帶來一定困難，也導(dǎo)致該菌在禽類養(yǎng)殖過程中廣泛流行[4-7]。本試驗(yàn)于2017—2019年采集焦作地區(qū)肉種雞場中疑似沙門菌病例的組織、死胚和病死雛雞等病料組織572份，從中分離得到109株沙門菌，說明該地區(qū)的肉種雞場中沙門菌感染嚴(yán)重，存在潛在威脅。因此，對(duì)沙門菌進(jìn)行凈化和防控具有重要的意義。

國內(nèi)許多研究表明，從養(yǎng)雞場中分離的沙門菌具有很強(qiáng)的耐藥性，呈現(xiàn)多重耐藥性。羊揚(yáng)等[6]研究表明，從廣西欽州地區(qū)采集的麻雞死胚分離得到164株沙門菌，其對(duì)磺胺異噁唑、四環(huán)素等抗菌藥耐藥性嚴(yán)重。吳曉君等[8]研究表明，從華東地區(qū)養(yǎng)雞場中分離的沙門菌對(duì)紅霉素、阿奇霉素、克林霉素等8種抗菌藥的耐藥率均超過50%。晏玲等[9]研究表明，從廣東黃羽肉種雞場死胚中分離的雞白痢沙門菌對(duì)磺胺異噁唑、萘啶酸、氨芐西林、四環(huán)素耐藥率均較高，且均呈現(xiàn)多重耐藥性。本試驗(yàn)顯示，分離的109株沙門菌對(duì)常用的抗菌藥均產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性。說明沙門菌耐藥性普遍存在，應(yīng)該引起重視，注意抗菌藥的合理使用。沙門菌耐藥性的產(chǎn)生不僅與外界抗菌藥的使用有關(guān)，還與攜帶的耐藥基因有關(guān)，耐藥基因可以通過多種途徑在動(dòng)物和人類之間傳播，不僅導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，還對(duì)人類健康造成隱患[10-11]。姜夢等[12]研究表明，從昆明某雞場分離的沙門菌攜帶多耐藥基因型。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離的109株沙門菌攜帶多種耐藥基因，攜帶耐藥基因型是否是引起耐藥性產(chǎn)生的主要因素，有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)為該地區(qū)的肉種雞場沙門菌的防控提供了科學(xué)依據(jù)。