姜偉，陳東榮，李琳

(1.滁州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，安徽滁州 239000；2.滁州市第一人民醫(yī)院，安徽滁州 239000)

頸椎病是一種與年齡密切相關(guān)的頸椎退行性疾病[1]，在我國(guó)患病率高達(dá)17.3%[2]。但是目前有關(guān)頸椎病的發(fā)病機(jī)理以及特異性藥物治療的相關(guān)研究仍較為缺乏。既往研究顯示，椎間盤細(xì)胞凋亡指數(shù)增加、細(xì)胞外基質(zhì)降解失衡以及生物學(xué)的改變等是椎間盤退變過(guò)程中的主要事件，其中椎間盤細(xì)胞凋亡或因?yàn)榧?xì)胞凋亡而導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂是椎間盤退變的重要因素[3-4]。因此，通過(guò)有效抑制或者減緩椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡，對(duì)于防治頸椎病具有重要意義。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定的重要途徑，在調(diào)控椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5-6]。地塞米松是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素，具有抗炎、消腫、鎮(zhèn)痛等作用，能夠有效改善脊髓型和神經(jīng)根型頸椎病患者的神經(jīng)功能，提高臨床療效[7-8]。但是目前有關(guān)地塞米松治療作用的機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建頸椎病模型大鼠，探究地塞米松對(duì)椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡以及Wnt/β-catenin信號(hào)軸相關(guān)蛋白Wnt1、GSK-3β和β-catenin表達(dá)的影響，以期為其臨床治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

雄性、SPF級(jí)、SD大鼠40只，購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所(許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水，晝夜交替光照，溫度維持在20～25 ℃，相對(duì)濕度60%～70%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：202002003)，實(shí)驗(yàn)滿足3R原則。

1.1.2 試劑

醋酸地塞米松注射液(成都天臺(tái)山制藥有限，國(guó)藥準(zhǔn)字：H21020514)；美洛昔康片(上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20020217 )；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，H-E)染色試劑盒(批號(hào)：C0105S)、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：C1088)、羊抗兔IgG抗體(批號(hào)：A0239)、羊抗鼠IgG抗體(批號(hào)：A0192)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)；Bax抗體(批號(hào)：ab36898)、Bcl-2抗體(批號(hào)：ab8805)、Wnt1抗體(批號(hào)：ab38449)、GSK-3β抗體(批號(hào)：ab32536)以及β-catenin抗體(ab32572)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；β-actin抗體(批號(hào)：AF5001)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)。

1.1.3 儀器

TWK-FST32型組織勻漿儀(武漢泰普拓公司)；Micro17R型高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；GPJ9-TS100-F型倒置熒光顯微鏡(日本尼康(Nikon)公司)；FC型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；1658033型電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad公司)；ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 頸椎病模型大鼠構(gòu)建及給藥處理

實(shí)驗(yàn)SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、地塞米松組、陽(yáng)性對(duì)照藥(美洛昔康)組，每組各10只。依據(jù)文獻(xiàn)[9]復(fù)制頸椎病模型大鼠，即對(duì)大鼠頸背部正中采取縱向切口，切口長(zhǎng)度約2 cm，使其充分暴露各層肌肉，橫向切斷深群頸夾肌、頭、頸、寰最長(zhǎng)肌，之后完全切除頸髂肋肌與頭半棘肌，依次切斷C2～C7棘上和棘間韌帶，縫合，手術(shù)后正常飼養(yǎng)1個(gè)月。對(duì)照組僅給予局部皮膚切開。實(shí)驗(yàn)通過(guò)H-E染色觀察頸椎病模型大鼠是否構(gòu)建成功。成功標(biāo)準(zhǔn)以纖維環(huán)軟骨表面粗糙、髓核皺縮，髓核與纖維環(huán)之間的分界模糊，且髓核位置偏移，伴有輕微的外突，軟骨細(xì)胞有退行性病變等現(xiàn)象判定造模成功。待造模成功后，地塞米松組大鼠給予尾靜脈注射0.4 mg/kg 的地塞米松，1次/d，14 d為一療程，共治療2個(gè)療程，每個(gè)療程間隔2 d。美洛昔康組大鼠進(jìn)行灌胃處理，灌胃劑量按照《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[10]人與大鼠體表面積藥物等效劑量計(jì)算為0.75 mg/kg，治療周期與地塞米松一致。

1.2.2 椎間盤纖維環(huán)組織病理學(xué)檢測(cè)

4%的多聚甲醛固定大鼠椎間盤纖維環(huán)組織，經(jīng)過(guò)包埋、切片、脫水，H-E染色觀察椎間盤纖維環(huán)組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡檢測(cè)

按照末端脫氧核糖轉(zhuǎn)移介導(dǎo)的生物素化脫氧尿嘧啶缺刻標(biāo)記(terminal deoxy nucleo tidyl transferase mediated dUTP-biotin nick-end labeling，TUNEL)法測(cè)定大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核呈棕色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。石蠟切片置于60℃烤箱內(nèi)脫蠟，然后使用二甲苯浸洗2次，每次約5 min。之后用梯度乙醇溶液(100%、95%、80%、70%)清洗各1次，每次約3 min。采用Proteinase K工作液處理心肌組織切片20 min，并在室溫條件下加入細(xì)胞通透液孵育10 min。PBS清洗切片，滴加TUNEL反應(yīng)混合液，反應(yīng)30 min。切片風(fēng)干后，加入50 μL的 Converter-POD，加上蓋玻片，37 ℃孵育30 min。PBS清洗切片后，加入DAB顯色液，孵育10 min，光學(xué)顯微鏡下觀察TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目并拍照。細(xì)胞凋亡率(%)=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)目×100%。

1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測(cè)Wnt1、GSK-3β和β-catenin表達(dá)

收集各組大鼠椎間盤纖維環(huán)組織并對(duì)組織碾磨；裂解；BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；凝膠電泳；濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜；上樣；用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育對(duì)應(yīng)Bax抗體(1：1000)，Bcl-2抗體(1：1000)，Wnt1抗體(1：1000)，GSK-3β抗體(1:1000)，β-catenin抗體(1：1000)以及β-actin抗體(1：2000)，4 ℃過(guò)夜，孵育對(duì)應(yīng)的羊抗兔IgG抗體或者羊抗鼠IgG抗體(1：5000)1～2 h，；搖床搖晃上加TPBS洗滌3次，5 min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。Bax、Bcl-2、Wnt1、GSK-3β和β-catenin蛋白表達(dá)水平以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值相比反映。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以“ˉx±S”表示，多組均數(shù)比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 地塞米松對(duì)頸椎病大鼠椎間盤纖維環(huán)組織病理學(xué)變化的影響

對(duì)照組大鼠椎間盤纖維環(huán)軟骨表面光滑，膠原纖維跑列規(guī)則，髓核與纖維環(huán)之間分界清晰。模型組大鼠纖維環(huán)軟骨表面粗糙，髓核皺縮，髓核與纖維環(huán)之間的分界模糊，且髓核位置偏移，伴有輕微的外突，軟骨細(xì)胞有退行性病變。地塞米松組和美洛昔康組大鼠椎間盤纖維環(huán)組織病理學(xué)損傷均得到明顯改善，軟骨退行性改變減輕。

2.2 地塞米松對(duì)頸椎病大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡的影響

如圖1、圖2所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡指數(shù)以及Bax表達(dá)均顯著升高(P<0.01)，Bcl-2表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，地塞米松組大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡指數(shù)以及Bax表達(dá)均顯著降低(P<0.01)，Bcl-2表達(dá)顯著升高(P<0.01)。

圖1 地塞米松對(duì)頸椎病大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡的影響(400×)注：與對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01。

圖2 地塞米松對(duì)頸椎病大鼠椎間盤纖維環(huán)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響注：與對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01。

2.3 地塞米松對(duì)頸椎病大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)軸的影響

如圖3所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞Wnt1、GSK-3β和β-catenin表達(dá)均顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，地塞米松組大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞Wnt1、GSK-3β和β-catenin表達(dá)均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

圖3 地塞米松對(duì)大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞Wnt1、GSK-3β和β-catenin表達(dá)的影響注：與對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05, ##P<0.01。

3 討論

椎間盤退行性病變與椎間盤組織細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。研究證實(shí)，椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致基質(zhì)代謝紊亂，進(jìn)而促進(jìn)其在組織、功能上發(fā)生變化，并最終誘發(fā)椎間盤硬化以及強(qiáng)度降低[11]。因此，通過(guò)尋找有效藥物抑制或延緩椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡，可能是改善椎間盤退行性病變的重要途徑之一。

地塞米松是臨床上常用的糖皮質(zhì)激素，能夠有效減輕神經(jīng)根水腫，是硬膜外阻滯的相應(yīng)配方藥物。既往研究顯示，地塞米松能夠改善椎間盤突出模型大鼠的機(jī)械疼痛[12]。另外，地塞米松能夠改善神經(jīng)根型頸椎病患者頸肩疼痛、上肢放射痛以及串麻感等典型癥狀[13]。而在多節(jié)段脊髓型頸椎病患者中，地塞米松能夠顯著減輕患者的疼痛癥狀以及降低術(shù)后并發(fā)癥[14]。以上研究表明，地塞米松能夠有效改善多種類型頸椎病。但是，目前有關(guān)地塞米松對(duì)于動(dòng)靜力失衡性頸椎病模型大鼠的作用尚不清楚。因此，本研究首先通過(guò)復(fù)制動(dòng)靜力失衡性頸椎病模型大鼠，觀察地塞米松的治療作用。結(jié)果顯示，模型組大鼠纖維環(huán)軟骨表面粗糙，髓核皺縮，髓核與纖維環(huán)之間的分界模糊，且髓核位置偏移，伴有輕微的外突，軟骨細(xì)胞有退行性病變，表明模型構(gòu)建成功。在模型構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上，通過(guò)大鼠尾靜脈注射地塞米松。結(jié)果顯示，大鼠椎間盤纖維環(huán)組織病理學(xué)損傷得到明顯改善，軟骨退行性改變減輕，表明地塞米松對(duì)大鼠頸椎間盤退行性病變具有一定的療效。細(xì)胞凋亡是椎間盤退行性病變的重要途徑，其中Bax/Bcl-2表達(dá)失衡是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性蛋白。為此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究地塞米松對(duì)頸椎病模型大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠椎間盤纖維環(huán)組織Bax表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高，表明椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞異常凋亡可能是造成椎間盤退行性病變的重要病理機(jī)制，這與以往研究結(jié)果一致[15]。與模型組相比，地塞米松組大鼠椎間盤纖維環(huán)組織Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低，表明地塞米松可能通過(guò)抑制椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善頸椎病大鼠椎間盤退行性病變。關(guān)于地塞米松調(diào)控椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡的相關(guān)途徑，Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖等生物學(xué)功能的關(guān)鍵途徑之一，在軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)、分化以及細(xì)胞外基質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。既往研究證實(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制主要為Wnt蛋白與細(xì)胞膜受體結(jié)合，進(jìn)而將信號(hào)傳導(dǎo)至胞內(nèi)抑制GSK-3β，降低β-catenin的降解，從而促使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離的β-catenin含量增加，異位至細(xì)胞核形成T細(xì)胞因子/淋巴樣增強(qiáng)因子復(fù)合物，調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)途徑中的靶基因，發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞凋亡作用。另外，Wnt信號(hào)途徑在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中同樣發(fā)揮了重要作用，其可以通過(guò)影響成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞等增殖和凋亡，促進(jìn)骨質(zhì)疏松以及骨質(zhì)侵蝕等進(jìn)展[16=17]。在椎間盤細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)被激活，細(xì)胞增殖顯著降低，加速了細(xì)胞衰老，從而促進(jìn)椎間盤退行性病變[18-19]。以上研究均共同表明，Wnt/β-catenin信號(hào)在椎間盤退行病變，特別是細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。為此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot檢測(cè)椎間盤纖維環(huán)組織Wnt/β-catenin信號(hào)相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠椎間盤纖維環(huán)組織Wnt1、GSK-3β和β-catenin表達(dá)均顯著降低，研究結(jié)果與Smolders等[20]一致。與模型組相比，地塞米松組大鼠椎間盤纖維環(huán)組織Wnt1、GSK-3β和β-catenin表達(dá)均顯著升高。

綜上所述，本研究顯示，地塞米松可能通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵因子Wnt1、GSK-3β和β-catenin蛋白表達(dá)，從而抑制頸椎病模型大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡。以上研究初步揭示了地塞米松對(duì)頸椎病椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供了新的理論基礎(chǔ)。

致謝：

感謝安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心老師提供平臺(tái)和指導(dǎo)全程實(shí)驗(yàn)！