付 穎， 柴曉嬌， 白曉雷， 王顯瑞， 沈軼男， 張 姼

(赤峰市農(nóng)牧科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古赤峰 024031)

谷子(L.)，又稱為粟，脫殼后稱為小米，具有自花授粉、基因組較小(約430 Mb)、抗旱耐瘠和糧草兼用等特點(diǎn)，是民眾膳食結(jié)構(gòu)改善和種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的主體作物。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究的不斷深入，谷子已經(jīng)發(fā)展成為禾本科基因組研究的模式植物之一。盡管我國(guó)是谷子的起源地，擁有豐富的種質(zhì)資源，同時(shí)依靠六十日、昭谷1號(hào)、矮88、噸谷等幾個(gè)谷子核心資源的發(fā)現(xiàn)和利用，谷子育種已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)步，但這也造成了遺傳背景狹窄，大多主栽品種仍以中稈和中高稈品種為主。因此，發(fā)掘、鑒定和利用新的谷子矮源，已成為實(shí)現(xiàn)谷子矮化育種最為直接的手段。此外，谷子高質(zhì)量全基因組測(cè)序的完成及一些矮稈早熟品種高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，也為谷子功能基因組學(xué)的研究提供了扎實(shí)的基礎(chǔ)。

我國(guó)對(duì)于谷子矮化機(jī)理的研究起歩較晚，前期主要是對(duì)谷子矮化突變體進(jìn)行遺傳分析和生理研究。進(jìn)入21世紀(jì)之后，研究人員才陸續(xù)開始對(duì)谷子矮化基因進(jìn)行定位、克隆等研究。高俊華等報(bào)道了一個(gè)谷子矮稈突變體安矮3號(hào)，并將突變基因定位在谷子3號(hào)染色體上。錢繼岳通過(guò)對(duì)47份谷子矮稈材料中矮稈基因的等位性分析，發(fā)現(xiàn)獲得的58個(gè)矮稈雜交組合中有45個(gè)組合含有非等位基因，7個(gè)組合含有等位基因。趙美丞在谷子中首次利用圖位克隆的方法分離了自然矮化突變體 84133的半顯性矮稈基因，其編碼一個(gè)DELLA蛋白，與赤霉素(GA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。隨后，谷子隱性矮稈基因和也相繼被發(fā)現(xiàn)，分別定位在3號(hào)染色體和8號(hào)染色體上。近些年來(lái)，一些研究人員在谷子矮稈基因的定位、克隆方面已經(jīng)取得了初步成果，但深入的基因解析尚未開展。目前，國(guó)內(nèi)育種人員利用矮88及其衍生系培育出的品種大多都是中稈品種。同時(shí)很多的谷子矮稈種質(zhì)還普遍存在不同程度的早衰現(xiàn)象，很難在育種中利用。因此，挖掘更多的農(nóng)藝性狀優(yōu)良的矮稈資源，就成為了當(dāng)前谷子矮化育種中亟待解決的問(wèn)題。

谷子突變體是經(jīng)過(guò)自然突變形成的一個(gè)矮稈突變體，其葉片直立，莖稈粗壯，株型緊湊，是優(yōu)良的谷子矮稈種質(zhì)資源。本研究以野生型 ZT002為對(duì)照，對(duì)的表型進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定分析，同時(shí)利用BSA(分離群體分組分析)與QTLseq 相結(jié)合的方法對(duì)突變基因進(jìn)行定位，旨在為谷子矮化育種提供可以利用的矮源，豐富和發(fā)展谷子矮化的分子機(jī)理，為進(jìn)一步進(jìn)行分子輔助選擇育種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2012年在谷子高稈品種中發(fā)現(xiàn)的1株經(jīng)過(guò)自然突變形成的矮稈突變體(命名為)，經(jīng)過(guò)多代自交純合后，其矮化性狀可穩(wěn)定遺傳，野生型為ZT002。

豫谷1號(hào)(Yugu1)是我國(guó)夏谷區(qū)廣泛栽培的品種，并最早完成了全基因組測(cè)序。SSR41是來(lái)自韓國(guó)的一個(gè)地方品種，目前已經(jīng)完成全基因組測(cè)序，該數(shù)據(jù)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院刁現(xiàn)民課題組提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 遺傳分析群體及作圖群體的構(gòu)建 2016年夏，將矮稈突變體(母本)與株高正常的Yugu1(父本)和SSR41(父本)分別進(jìn)行雜交即×Yugu1和×SSR41，該試驗(yàn)于赤峰市農(nóng)牧科學(xué)研究所試驗(yàn)站(118°52′0″E、42°17′38″N)進(jìn)行。2016年冬在海南三亞南濱農(nóng)場(chǎng)種植2個(gè)雜交組合的F代，并分別收集F代真雜種的種子。2017年春在赤峰市農(nóng)牧科學(xué)研究所試驗(yàn)站種植2個(gè)雜交組合的F代群體。2個(gè)雜交組合的F代群體均用于基因精細(xì)定位，僅有×Yugu1組合的F代群體用來(lái)做突變體的遺傳分析。同時(shí)，將野生型ZT002也在同一地塊進(jìn)行種植，用于的表型鑒定。

1.2.2 突變體的表型鑒定及遺傳分析 于植株進(jìn)入成熟期時(shí)，隨機(jī)選取6株和ZT002進(jìn)行相關(guān)農(nóng)藝性狀調(diào)查。同時(shí)調(diào)查和豫谷1號(hào)、F及F群體各單株的株高，統(tǒng)計(jì)正常株高與矮稈植株的比率，并用卡方測(cè)驗(yàn)分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.3 BSA+QTLseq法進(jìn)行突變基因的定位 在2組F群體中分別選取30株極端矮稈植株，按單株剪取1～2張健康葉片用于DNA的提取，并測(cè)定其濃度，然后將30株單株的DNA 等量混合，分別構(gòu)建2個(gè)矮稈混池。

通過(guò)Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)2個(gè)混池樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，利用QTLseq法對(duì)2個(gè)混池的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，初步確定突變基因所在的染色體和候選區(qū)間，然后在初定位的基礎(chǔ)上利用BSA法進(jìn)行基因定位。根據(jù)重測(cè)序得到的親本之間純合的SNP(單核苷酸多態(tài)性)和InDel(插入缺失序列)設(shè)計(jì)多態(tài)性好的標(biāo)記，并利用這些標(biāo)記定位基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體si-dw4的表型分析

前期研究發(fā)現(xiàn)，突變體葉片直立，莖稈粗壯，穗莖節(jié)顯著縮短，株型緊湊，抗倒性強(qiáng)，是優(yōu)良的谷子矮稈種質(zhì)資源。在成熟期，對(duì)突變體和野生型ZT002 的莖稈部性狀進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)的株高為35.90 cm，ZT002的株高為130.83 cm，突變體的株高只是野生型ZT002的27.44%(表1，圖1-B)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)的莖稈也更加粗壯，達(dá)到10.13 mm(表1)。對(duì)突變體與ZT002 的節(jié)間進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，和ZT002均具有13個(gè)節(jié)間，并且每一個(gè)節(jié)間都比野生型中相應(yīng)的節(jié)間短(圖1-A)，這與前人研究結(jié)果基本一致，都是由于節(jié)間縮短導(dǎo)致的矮化。

表1 突變體 si-dw4和野生型ZT002莖稈部農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)

2.2 si-dw4矮稈性狀的遺傳分析

在赤峰和海南連續(xù)種植多代，均表現(xiàn)為矮稈性狀。將突變體與具有正常株高的Yugu1做雜交，得到的F代植株全部表現(xiàn)為正常株高，表明矮稈性狀是隱性性狀。在雜交得到的F分離群體中株高分離明顯，存在中間類型，通過(guò)測(cè)量358株 F群體的株高，發(fā)現(xiàn)最矮植株的株高為33.50 cm，最高為142.30 cm，株高位于120.6～130.0 cm區(qū)間的植株最多，且符合正態(tài)分布規(guī)律(圖2)。充分說(shuō)明F分離群體的株高由主效基因控制，可以把株高性狀看作質(zhì)量性狀進(jìn)行分析定位。

2.3 F2群體株高的統(tǒng)計(jì)分析

表2 F2代的株高性狀分離情況統(tǒng)計(jì)分析

2.4 si-dw4突變基因的定位

對(duì)×Yugu1 F和×SSR41 F分離群體的矮稈隱性混池進(jìn)行高通量測(cè)序。對(duì)2個(gè)混池的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)SNP數(shù)量在100萬(wàn)～200萬(wàn)，InDel在20萬(wàn)～40萬(wàn)，利用QTLseq軟件作圖，并不能得到顯著的峰值。因此，本研究利用排除法進(jìn)行進(jìn)一步分析，首先將×Yugu1和×SSR41 2個(gè)群體都檢測(cè)到的變異位點(diǎn)取交集，再利用Yugu1和SSR41的全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的所有變異位點(diǎn)做過(guò)濾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一半以上變異位點(diǎn)集中在5號(hào)染色5～9 Mb區(qū)間內(nèi)， 因此將該區(qū)間作為候選區(qū)間。根據(jù)候選區(qū)間內(nèi)的InDel位點(diǎn)設(shè)計(jì)了多個(gè)標(biāo)記(表3)，并利用×Yugu1的 F分離群體進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記In5-6.23和In5-8.12擴(kuò)增混池 DNA可以得到與母本帶型一致的條帶(圖3)，說(shuō)明突變基因與這2個(gè)標(biāo)記緊密連鎖。根據(jù)重測(cè)序分析結(jié)果，已經(jīng)幾乎沒(méi)有InDel位點(diǎn)可以使用，再無(wú)法設(shè)計(jì)出InDel標(biāo)記將定位區(qū)間進(jìn)一步縮小。因此，將突變基因定位于In5-6.23(6 225 727 bp)與 In5-8.12(8 123 723 bp)之間的1.89 Mb 區(qū)間內(nèi)。

表3 基因定位所用的標(biāo)記

3 討論與結(jié)論

3.1 對(duì)si-dw4突變基因的分析

本研究中，對(duì)突變體和野生型ZT002的節(jié)間長(zhǎng)度進(jìn)行調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)和ZT002的節(jié)間數(shù)目一致，并沒(méi)有發(fā)生變化，說(shuō)明的矮化是由于節(jié)間縮短導(dǎo)致的。在前期對(duì)突變體農(nóng)藝性狀的研究中，通過(guò)與野生型相比，的葉片呈直立狀，株型也更加緊湊，說(shuō)明該突變基因也參與了株型的調(diào)控。前人研究表明，在水稻中dm、dn和n1這3種矮稈突變體的矮化都是節(jié)間明顯縮短而導(dǎo)致的。同樣，在玉米矮稈突變體中，最為明顯的表型特征也是節(jié)間的變化，一般多表現(xiàn)為節(jié)間數(shù)目減少，節(jié)間長(zhǎng)度縮短，特別是雌穗以下的節(jié)間變化尤為明顯。隨著研究的深入，目前在水稻、玉米、茄科和葫蘆科植物中均已鑒定出這類矮稈突變體，它們的突變基因可以使節(jié)間數(shù)目減少，節(jié)間長(zhǎng)度縮短，導(dǎo)致植株產(chǎn)生矮化，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了部分基因兼具株型調(diào)控作用，如控制葉片的直立性，使株型緊湊等。當(dāng)然隨著矮稈種質(zhì)資源的不斷利用，植物的矮化機(jī)理研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，育成的多個(gè)矮稈、抗倒、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的作物品種也得到了迅速推廣。但在谷子矮化育種中，目前可以利用的矮稈資源卻仍然存在早衰和遺傳基礎(chǔ)不明確等問(wèn)題，導(dǎo)致很難在育種中利用，阻礙了谷子的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。因而，更多新的矮稈基因的發(fā)掘不但可以為谷子矮化育種水平的提高帶來(lái)更多的新突破，也為其他農(nóng)作物、園藝作物的矮化改良提供了先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)。

3.2 si-dw4突變基因的精細(xì)定位

本研究將突變基因定位在第5染色體1.89 Mb區(qū)間內(nèi)，沒(méi)能完成精細(xì)定位。一方面由于標(biāo)記 In5-6.23 與In5-8.12之間已沒(méi)有可利用的InDel位點(diǎn)，很難再開發(fā)出新的InDel標(biāo)記；另一方面原因是作圖群體數(shù)量較少，構(gòu)建的遺傳圖譜精度較低，導(dǎo)致進(jìn)行基因定位時(shí)檢測(cè)到的重組圖譜偏大而檢測(cè)不到重組事件，進(jìn)而表現(xiàn)為重組交換率偏低。為解決這些問(wèn)題，本研究計(jì)劃一方面基于重測(cè)序獲得的SNP位點(diǎn)信息，利用dCAPS Finder 2.0和Primer 3(http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)來(lái)開發(fā)CAPS(酶切擴(kuò)增多態(tài)性)標(biāo)記引物，進(jìn)一步加密遺傳圖譜；另一方面增大作圖群體數(shù)量，構(gòu)建精度更高的遺傳圖譜，精細(xì)定位突變基因。