李輝玲， 張建文， 李守明

(1.巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，新疆庫爾勒 8410001；2.石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，新疆石河子 832000)

大蒜(L.)別稱胡蒜，是百合科蔥屬中重要的蔬菜植物，兼有藥用價值，被譽為“植物黃金”，在我國山東、河南、江蘇、河北以及新疆等地廣泛種植。其生長時間短、病蟲害較輕，并且其精、深加工產(chǎn)業(yè)已初步形成，使其走俏歐洲、美國。但是一直以來，大蒜品種的篩選鑒定工作還不深入，品種資源存在同名異物或同物異名現(xiàn)象，另外大蒜長年無性繁殖所產(chǎn)生的品種退化嚴(yán)重、相互引種但背景資料缺失等問題不利于優(yōu)異大蒜品種的推廣和應(yīng)用。

遺傳變異是指不同個體或不同種類之間的變異之和，本質(zhì)上是遺傳物質(zhì)的堿基對排序和結(jié)構(gòu)排序變化。遺傳多樣性工作的開展可以直觀地了解種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性水平，為育種工作中的品種區(qū)分、分組、父母本選擇、野生稀有物種的保護等提供依據(jù)。通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法來研究遺傳多樣性具有簡單、直觀的優(yōu)點，但表觀形態(tài)受基因、外部環(huán)境共同影響，只能間接反映其遺傳物質(zhì)的本質(zhì)特征，并且可檢測的信息量也較少，存在一定的缺陷和局限性。分子標(biāo)記技術(shù)是基于DNA多態(tài)性建立起來的方法，DNA堿基雙螺旋結(jié)構(gòu)排列的順序就是作物的遺傳信息，因此直接分析和比較DNA的堿基序列結(jié)構(gòu)是最優(yōu)的遺傳多樣性分析方式。簡單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記廣泛分布于植物基因組上，呈現(xiàn)共顯遺傳特性，具有豐富的多態(tài)性，目前被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、遺傳多樣性分析、數(shù)量性狀座位(QTL)定位分析和品種純度鑒定等領(lǐng)域。

綜上所述，明確大蒜的遺傳背景信息和種質(zhì)資源多樣性，不僅可為評價與鑒定大蒜品種提供科學(xué)依據(jù)、為育種工作提供理論支持，而且也為優(yōu)異品種實現(xiàn)種子繁殖奠定了理論基礎(chǔ)，并能加速優(yōu)良品種的大面積推廣。本研究以63份不同地區(qū)來源的大蒜為材料，運用50對SSR引物分析供試大蒜種質(zhì)資源的遺傳多樣性，以期解決大蒜品種存在的同名異物問題，最終為大蒜資源的品種評價與鑒定提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試63份大蒜種質(zhì)資源分別由巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院特色作物室、新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院園藝所收集并提供，其中來自新疆的種質(zhì)11份，來自云南的種質(zhì)10份，來自甘肅、山東的種質(zhì)各6份，來自河南的種質(zhì)5份，來自河北的種質(zhì)4份，來自遼寧、四川的種質(zhì)各3份，來自安徽、湖南、陜西的種質(zhì)各2份，來自貴州、江蘇的種質(zhì)各1份，野生資源7份(表1)。將63份大蒜種質(zhì)資源于2021年4月初種植于巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗田及新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗田內(nèi)，按照常規(guī)田間管理。2021年6月每個品種隨機采集5株嫩葉，未出苗的品種以鱗莖為材料，放置于液氮罐中處理后及時存貯于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)備用。試驗時稱取200 mg左右葉片，用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的新型植物基因組DNA提取試劑盒抽提材料的DNA，80 mg左右鱗莖用傳統(tǒng)的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)手提法提取DNA。

表1 63份大蒜種質(zhì)的資源信息

1.2 DNA質(zhì)量及濃度的檢測

提取63份大蒜資源的DNA，DNA濃度和純度用核酸檢測儀(NanoDrop-1000)結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳法測定。根據(jù)測定值和前期優(yōu)化的PCR體系所需的DNA模板濃度，將所有樣品濃度稀釋到 30 ng/μL，放置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 引物設(shè)計與合成

參考Barboza等的研究，共設(shè)計50對引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4 PCR擴增

根據(jù)前期優(yōu)化試驗，確定大蒜SSR-PCR反應(yīng)體系(10 μL)：30.0 ng模板DNA、各0.5 μmol/L正反向引物、5.0 μL 2×PCR Mix，用dd HO補齊。擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，在不同引物的上、下游平均溫度下退火45 s，72 ℃延伸90 s；30次循環(huán)的最后1個循環(huán)的延伸時間設(shè)為10 min；4 ℃保存擴增產(chǎn)物。

采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳結(jié)果分析擴增產(chǎn)物，電泳儀參數(shù)：120 V恒定電壓，電流200 mA，時間75 min。電泳結(jié)束后小心拆膠，用銀染法顯色至條帶清晰可辨，在醫(yī)用膠片觀察燈下拍照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)擴增結(jié)果的重復(fù)性、擴增產(chǎn)物的條帶數(shù)量及清晰程度、多態(tài)性表現(xiàn)等篩選表現(xiàn)較為優(yōu)異的SSR引物。統(tǒng)計分析各個引物處理下每個樣品擴增產(chǎn)物的電泳條帶，同一遷移位置處有條帶的記為1，無條帶的記為0，缺失的記為9，組成1和0矩陣，在Excel表中登記。用NTSYS-pc(Version 2.10e)軟件進行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)聚類圖，計算遺傳相似性系數(shù)(genetic similar coefficient，GS)和遺傳距離(genetic distance，GD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA模板的檢測

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測隨機挑選的14份大蒜資源DNA的質(zhì)量(圖1中1～9為試劑盒提取，10～14為傳統(tǒng)CTAB法提取)。如圖1所示，所提DNA條帶整齊一致、帶型清晰、濃度均勻。核酸檢測儀測定結(jié)果顯示，所提DNA的/位于 1.85～2.00之間，濃度為61～93 ng/μL，可以稀釋為30 ng/μL用于后續(xù)SSR-PCR分析。

2.2 SSR擴增結(jié)果

以6份生物學(xué)性狀差異較大、親緣關(guān)系較遠的大蒜材料為模板，利用優(yōu)化后的最佳SSR-PCR反應(yīng)體系和循環(huán)數(shù)，對50對SSR引物進行篩選，淘汰擴增效果不佳、帶型不好辨認的引物，最終篩選出33對引物對63份材料有特異性條帶，特異性檢出率為66%；共擴增出353條條帶，其中多態(tài)性條帶162條，多態(tài)性比例為45.89%(表2)。不同引物所得擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果存在明顯差異，本試驗中，每對引物可擴增出2～22條條帶，多態(tài)性條帶數(shù)共162條，每對前期多態(tài)性表現(xiàn)良好的引物平均產(chǎn)生4.9條條帶。圖2是引物ASM072在63份新疆大蒜及其野生蒜種中的擴增情況，平均每對引物能夠擴增出10.69個位點，表明大蒜資源間的遺傳多樣性較為豐富，所用SSR標(biāo)記多態(tài)性表現(xiàn)較好。

表2 篩選出的33對大蒜SSR多態(tài)性引物

2.3 SSR聚類分析

用33對多態(tài)性差異表現(xiàn)優(yōu)異的引物對63份新疆大蒜及其野生蒜種進行聚類分析，結(jié)果表明，63份大蒜資源的遺傳相似系數(shù)位于0.41～0.9之間。如圖3所示，可在遺傳相似系數(shù)0.5處將63份新疆大蒜及其野生蒜種分成4個大類群，其中第1類群包含40份材料；第2類群包含15份材料；第3類群包含7份材料，為7份野生資源；第4類群包含1份材料，為貴州畢節(jié)蒜。聚類結(jié)果表明，大部分地理區(qū)域位置相近或相同的品種被聚在一起，比如第2類群包含15份材料，其中8份資源主要來自云南地區(qū)；第3類群包含的7份材料全部來源于烏魯木齊，為野生蒜，但也有少部分地理區(qū)域位置較遠的蒜種被聚在一起，如來自山東濰坊的大蒜(1號)與來自新疆石河子的資源(4、5號)被聚到第1類群的小亞群中；來自山東金鄉(xiāng)的大蒜(2號)與來自遼寧黑山、陜西漢中的資源(22、24號)聚到了第1類群的小亞群中，造成這種現(xiàn)象的原因很可能是地區(qū)間引種，說明不同區(qū)域間的大蒜資源存在一定的基因交流情況。非加權(quán)組平均法(UPGMA)聚類分析結(jié)果表明，本研究設(shè)計的SSR標(biāo)記引物能夠有效區(qū)分不同地域及距離來源的大蒜資源并相對精確地鑒定資源間的親緣關(guān)系。基于相似系數(shù)的結(jié)果，進一步對SSR-PCR反應(yīng)結(jié)果進行主坐標(biāo)分析，發(fā)現(xiàn)前3個主坐標(biāo)的多態(tài)性貢獻值分別為 20.34%、8.39%和6.63%。對63份大蒜材料在第1、第2主坐標(biāo)構(gòu)成的二維圖(圖4)、3個主坐標(biāo)構(gòu)成的三維圖(圖5)中進行分類，由圖4、圖5可見，63份大蒜材料在第1、第2主坐標(biāo)排序中可分為6類，其中22(云南獨頭4號)、46(阿合奇縣大蒜)距離其他材料較遠，因此將它們重新單獨分組。

綜合上述3個主坐標(biāo)的分析結(jié)果，63份大蒜材料可分為6個類群。分析比較得出，圖3、圖4、圖5的結(jié)果與63份大蒜材料的聚類分析結(jié)果基本一致。在主坐標(biāo)的分析中，第2類群基本一致，可將聚類分析結(jié)果中的第3、第4類群歸為1類，將聚類分析中的第1類群分為2個組群，主坐標(biāo)分析后的分組結(jié)果和聚類分析后的分組結(jié)果大體一致。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同部位DNA提取的比較分析

一般通過取幼嫩組織來獲得較高質(zhì)量的DNA，既容易破壁又能夠避免經(jīng)過不同程度的發(fā)育后細胞內(nèi)其他組分的干擾。在本研究中，利用大蒜鱗莖和葉片提取的DNA進行SSR-PCR得到的試驗結(jié)果沒有明顯差別，說明SSR擴增反應(yīng)中對模板DNA的質(zhì)量沒有太高要求，但試驗中發(fā)現(xiàn)，從大蒜不同部位提取的模板DNA濃度和質(zhì)量有很大差異。大蒜鱗莖中存在大量多糖，用試劑盒抽提除雜不充分，材料的用量不宜過多，最好控制在0.2 g以內(nèi)，否則大量多糖成分會產(chǎn)生很多黏液，從而干擾抽提效果。綜合試驗結(jié)果，用大蒜不同部位取材抽提的DNA對擴增效果的影響很小，可根據(jù)實際情況，在保證產(chǎn)率及質(zhì)量的前提下合理選擇取材部位。

3.2 大蒜資源間遺傳多樣性分析

本試驗利用33對多態(tài)性SSR引物將63份新疆大蒜及其野生蒜種分為6個大類群，大多數(shù)來自同一地域的材料被聚為1類，說明本研究開發(fā)設(shè)計的SSR引物能夠有效區(qū)分不同地域距離來源的大蒜資源，有一定的應(yīng)用價值。也有少部分地域距離較遠的大蒜材料被聚為1類，說明大蒜材料背景來源復(fù)雜且不同地域間存在一定的基因交流情況。因此本研究選用的SSR引物可以判斷不同品種或材料間是否有基因交流的現(xiàn)象，也可以用于分析種源間的親緣關(guān)系。