曾美娟， 劉建汀， 李祖亮， 陳敏氡， 葉新如， 王 彬， 朱海生， 溫慶放

(1.福建省蔬菜遺傳育種重點實驗室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心，福建福州 350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建福州 350003)

生長素是一種重要的植物激素，是最早被發(fā)現(xiàn)的能促進(jìn)植物生長的激素，其在植物生長過程的多個重要環(huán)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。植物體內(nèi)的生長素在自由態(tài)和束縛態(tài)2種形式間的轉(zhuǎn)化是體內(nèi)生長素水平的自我調(diào)節(jié)功能，對植物生長的調(diào)控具有重要意義。在植物生長素響應(yīng)信號通路中，有3類早期生長素響應(yīng)基因家族[Aux/IAAs(auxin/indole-3-acetic acids)、GH3s(gretchen hagen 3)、SAURs(small auxin upRNAs)]能快速特異地表達(dá)反應(yīng)。其中，基因家族能夠催化游離態(tài)的吲哚-3-乙酸(IAA)與多種氨基酸結(jié)合，生成IAA-氨基酸復(fù)合物，將游離IAA 轉(zhuǎn)化為復(fù)合態(tài)的IAA，可以參與生長素的穩(wěn)態(tài)調(diào)控，進(jìn)而參與調(diào)控植物的多個生理過程，其對整個基因家族的研究具有重要意義。

普通絲瓜[(L.) Roem.]是我國主要的瓜類蔬菜之一，其肉質(zhì)清香軟滑，既富含營養(yǎng)，又具有清熱化痰、涼血解毒等保健作用，倍受各地區(qū)消費者喜愛。基因?qū)χ参锏纳L發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，但在普通絲瓜中關(guān)于基因家族的研究鮮有報道。因此，本研究以普通絲瓜為試驗材料，基于普通絲瓜全基因組對基因家族成員進(jìn)行鑒定、生物信息學(xué)分析，并分析其在普通絲瓜長果品種、短果品種中的表達(dá)情況，對后續(xù)研究普通絲瓜果實發(fā)育和果實果長等具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

普通絲瓜的基因組數(shù)據(jù)從國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺(https：//db.cngb.org/)上獲取。本研究所用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為普通絲瓜長果品種(花后 12 d)和短果品種(花后12 d)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，絲瓜樣品為2021年種植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗基地的試驗材料。普通絲瓜長果樣品、短果樣品分別混合取樣，試驗設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，絲瓜樣品用液氮速凍后于-80 ℃保存，用于RNA-seq分析。

1.2 普通絲瓜基因組中GH3基因家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析

通過Pfam數(shù)據(jù)庫(http：//pfam.xfam.org/)獲得GH3保守結(jié)構(gòu)域的HMM模型(PF03321)，并用TBtools軟件進(jìn)行simple HMM search，對普通絲瓜的基因組蛋白序列進(jìn)行搜索，獲得初篩蛋白序列。再通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站進(jìn)一步驗證初篩獲得的候選蛋白結(jié)構(gòu)域，獲得確定的成員后，根據(jù)普通絲瓜的拉丁名(L.) Roem，將普通絲瓜編碼上述蛋白的基因定為基因。通過ProtParam在線分析網(wǎng)站分析普通絲瓜LcGH3蛋白的理化性質(zhì)。

1.3 普通絲瓜GH3基因家族成員蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分析

利用NCBI保守結(jié)構(gòu)域在線分析網(wǎng)站和MEME在線分析網(wǎng)站進(jìn)行普通絲瓜GH3蛋白的保守結(jié)構(gòu)域與基序(Motif)分析，并用TBtools軟件繪制示意圖。

1.4 普通絲瓜GH3基因家族成員蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

為探究普通絲瓜基因家族成員蛋白的進(jìn)化關(guān)系，從NCBI網(wǎng)站下載南瓜、黃瓜及擬南芥的GH3蛋白序列與普通絲瓜GH3蛋白序列，進(jìn)行合并系統(tǒng)進(jìn)化分析。利用MEGA軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining)對普通絲瓜、黃瓜、南瓜和擬南芥GH3家族蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。用在線工具iTOL對已構(gòu)建的普通絲瓜、黃瓜、南瓜和擬南芥的GH3家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行美化處理。

1.5 普通絲瓜長果品種、短果品種GH3基因家族成員的差異表達(dá)模式分析

根據(jù)筆者所在課題組前期研究得出的普通絲瓜長果品種、短果品種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的基因表達(dá)值(FPKM)，分析普通絲瓜基因家族成員在普通絲瓜長果品種、短果品種中的表達(dá)情況，采用TBtools繪制表達(dá)量熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通絲瓜GH3基因家族成員蛋白的鑒定及理化性質(zhì)分析

通過對普通絲瓜基因家族成員進(jìn)行篩選和鑒定，最終確定14個基因，暫將其命名為～。通過ProtParam在線分析軟件獲得普通絲瓜LcGH3蛋白氨基酸序列的蛋白序列長度、分子量、蛋白酸堿性和穩(wěn)定性等基本信息。從表1可以看出，普通絲瓜LcGH3蛋白的蛋白序列長度為515～843 aa，分子量為58.366～96.406 ku；從等電點可以看出，LcGH3.8、LcGH3.14為堿性蛋白，其他普通絲瓜的LcGH3蛋白都為酸性蛋白；LcGH3.1的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，表明其是穩(wěn)定蛋白，其他普通絲瓜LcGH3蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定蛋白。在蛋白質(zhì)親水性方面，14個普通絲瓜LcGH3蛋白的平均親水系數(shù)均為負(fù)數(shù)，表明它們都是親水蛋白。

表1 普通絲瓜GH3基因家族成員蛋白的理化性質(zhì)

2.2 普通絲瓜GH3基因家族成員蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

對普通絲瓜基因家族成員蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)14個基因家族成員蛋白均含有單一的GH3結(jié)構(gòu)域，其中LcGH3.1、LcGH3.2和LcGH3.4等11個蛋白含有GH3超家族結(jié)構(gòu)域(圖1)。為了進(jìn)一步研究普通絲瓜基因家族成員蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，利用MEME在線分析軟件對普通絲瓜GH3蛋白保守基序進(jìn)行分析。從圖2可以看出，普通絲瓜GH3蛋白的基序具有一定的保守性。14個普通絲瓜基因家族成員的蛋白質(zhì)序列中至少含有10個保守基序，它們分別為Motif 1～Motif 10，并且這些保守基序的排列順序相同。其中，LcGH3.8蛋白缺少Motif 10、Motif 2，LcGH3.9蛋白缺少Motif 3，LcGH3.10蛋白缺少Motif 8，其他基因家族成員同時含有10個保守基序。此外，這14個普通絲瓜GH3蛋白家族成員中均含有Motif 1、Motif 4、Motif5、Motif6、Motif7和Motif 9。

2.3 普通絲瓜GH3基因家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

用MEGA軟件構(gòu)建普通絲瓜GH3家族蛋白(14個)、黃瓜GH3家族蛋白(14個)、南瓜GH3家族蛋白(29個)和擬南芥GH3家族蛋白(30個)的系統(tǒng)進(jìn)化樹。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹的進(jìn)化關(guān)系，這87個GH3蛋白可分為3類，分別是GroupⅠ、Group Ⅱ和Group Ⅲ(圖3)。其中，南瓜、絲瓜和黃瓜的GH3蛋白屬于Group Ⅱ或Group Ⅲ；在普通絲瓜中，LcGH3.3、LcGH3.7、LcGH3.13屬于Group Ⅱ，其他11個絲瓜GH3蛋白屬于Group Ⅲ；此外，在Group Ⅱ、Group Ⅲ中也有擬南芥的GH3蛋白。值得注意的是，GroupⅠ中都是擬南芥的GH3蛋白。

2.4 普通絲瓜長果品種、短果品種GH3基因家族成員的差異表達(dá)模式分析

基于普通絲瓜長果品種、短果品種商品果的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中14個基因家族成員的基因表達(dá)值(FPKM)，分析基因家族成員的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)在普通絲瓜長果品種、短果品種商品果中共有6個基因家族成員(、、、、和)存在差異表達(dá)，其中、、在短果品種中的相對表達(dá)量高于長果品種，、、在短果品種中的相對表達(dá)量低于長果品種(圖4)。

3 討論與結(jié)論

植物的基因是一種典型的植物生長素原初反應(yīng)基因，廣泛存在于植物中。GH3蛋白通過調(diào)節(jié)植物激素和相關(guān)化合物(包括植物激素前體)的活性或可利用性，在信號通路、器官發(fā)育、植物結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)植物的抗逆性、優(yōu)化植物的生長和代謝過程中起著重要作用?；蜃钤缭诖蠖怪斜昏b定為早期的生長素響應(yīng)基因。迄今，研究者陸續(xù)在許多來自不同植物(如擬南芥、水稻、葡萄、番茄、桃、木瓜、獼猴桃、甘藍(lán)等)的基因家族中發(fā)現(xiàn)該基因家族成員。

本研究結(jié)果表明，普通絲瓜中的14個LcGH3蛋白主要含10個Motif，且14個LcGH3蛋白均含有Motif 1、Motif 4、Motif5、Motif6、Motif7和Motif 9保守基序，推測這6個保守基序可能在普通絲瓜基因中發(fā)揮主要功能。構(gòu)建基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹來分析同源基因間的進(jìn)化關(guān)系，可為后續(xù)基于同源同功假說的分析奠定基礎(chǔ)。本研究通過構(gòu)建普通絲瓜、黃瓜、南瓜和擬南芥基因家族成員蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)南瓜、絲瓜和黃瓜的GH3蛋白屬于Group Ⅱ或Group Ⅲ，而在GroupⅠ中都是擬南芥的GH3蛋白，后續(xù)關(guān)于絲瓜GH3的功能研究可以借鑒黃瓜、南瓜中已有的相關(guān)研究。本研究結(jié)果表明，在普通絲瓜長果品種、短果品種商品果中共有6個基因家族成員存在差異表達(dá)，推測基因家族與普通絲瓜果實發(fā)育相關(guān)，且與果長關(guān)系密切。對桃、番茄GH3蛋白的相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，基因在果實不同發(fā)育時期的表達(dá)量均存在差異。在研究中，、、在短果品種中表達(dá)量高于長果品種，、和在短果品種中的表達(dá)量低于長果品種，將為后續(xù)研究絲瓜果長提供方向。

本研究基于普通絲瓜全基因組對基因家族進(jìn)行鑒定，鑒定獲得14個基因家族成員，開展生物信息學(xué)分析并探析其在普通絲瓜長果品種、短果品種中的表達(dá)情況，為后續(xù)繼續(xù)深入研究基因在普通絲瓜果實發(fā)育及果長中的作用奠定了基礎(chǔ)，并可為培育滿足市場多樣化優(yōu)良果長的絲瓜品種提供支撐。