武兆云， 孫聚濤， 張智強， 薛 剛， 楊鐵釗

(河南農業(yè)大學煙草學院，河南鄭州 450002)

茉莉酸主要包括茉莉酸甲酯(MeJA)及其前體茉莉酸(JA)。作為植物生長調節(jié)劑，茉莉酸在植物生長發(fā)育過程中起著明顯作用，如種子萌發(fā)、花粉發(fā)育等，并能應對病原體感染、機械和害蟲、非生物脅迫等。JA生物合成途徑始于-亞麻酸，由質體內的13-脂肪氧化酶(LOX)催化，游離-亞麻酸轉變成13-氫-過氧十八碳三烯酸[13-(OOH)-18 ∶3]。隨后，丙二烯氧化合酶(AOS)將13-(OOH)-18 ∶3轉化為高度不穩(wěn)定的丙二烯氧化中間體，隨后該中間體受到丙二烯氧化環(huán)化酶(AOC)的作用，產生12-氧代植物二烯酸(12-oxophytodienoic acid，12-OPDA)。OPDA隨后從質體輸送到過氧化物酶體中，在過氧化物酶體中，OPDA被OPDA還原酶3(OPR3)還原，然后經過3輪β-氧化，產生JA。

JA與植物非生物脅迫密切相關。在非生物脅迫中，干旱對農作物產量的制約最大。關于玉米的研究結果表明，在干旱脅迫下，4個轉錄本的表達量呈上調趨勢，在伸長組織、成熟組織中的表達量最高。在干旱條件下，植物的整體LOX活性和丙二醛(MDA)含量與轉錄水平之間存在密切關系。因此可見，茉莉酸含量可能會隨脂質氧化脅迫而增加，因為茉莉酸的生物合成包含氧化脂合成。缺氧對植物生長有嚴重的不利影響，并會造成嚴重的農業(yè)損失。最近的研究結果表明，外源茉莉酸甲酯可以增強野生型擬南芥對再氧化的耐受性，并且在JA生物合成過程中的突變體對再氧化表現(xiàn)出更高的敏感性。鋁毒性是限制酸性土壤作物生產的另一個主要因素。根據(jù)JA生物合成或信號傳導中突變缺陷的表型分析結果，JA在調節(jié)鋁脅迫下的根生長抑制中發(fā)揮作用，外源施用JA增強了鋁脅迫下的擬南芥根生長抑制。

作為植物生長和發(fā)育的關鍵大量營養(yǎng)元素，鉀參與許多生理過程，包括酶激活、膜電勢維持、電中和、氣孔運動和滲透調節(jié)。迄今還沒有文獻闡明JA信號在植物缺鉀中的作用，本研究旨在分析、和基因的分子特性和表達模式，了解其在煙草低鉀脅迫下的調控作用，從而揭示JA合成途徑參與煙草低鉀脅迫的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料和培養(yǎng) 將表面消毒的煙草種子(品種：ND202、NC89)播種在無菌培養(yǎng)皿中。NC89屬于耐低鉀品種，ND202屬于低鉀敏感品種。將煙草種子置于K充足(Hoagland配方，K濃度為 6 mmol/L)或低K(記為LK，K濃度為125 μmol/L)的培養(yǎng)基上。LK培養(yǎng)基由Hoagland培養(yǎng)基改良而成，添加1%(質量濃度)瓊脂。

將幼苗置于相對濕度為70%的生長室中，在 28 ℃ 條件下光照培養(yǎng)16 h，然后在21 ℃條件下黑暗培養(yǎng)8 h。光照度約為100 μmol/(m·s)，7 d后收獲新鮮的根，用于基因克隆。本試驗于2021年3—8月在河南農業(yè)大學煙草學院育種試驗室開展。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆 使用()、()、()核苷酸序列作為查詢序列，進行NCBI BLAST搜索(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，旨在識別煙草核苷酸收集NR/NT數(shù)據(jù)庫中包含、和直向同源物的序列，從而搜尋出(X84040)、(AB778304)和(AJ308487)。

用3對引物進行PCR擴增：，上游引物5′-C G T T T T T C T T G G A A G G T T A T T G A G A G A G-3′，下游引物5′-A C A A T T T A G A A C T G G G C A C T T T G T G-3′；，上游引物5′-A T G G C A G T A G C A A C A G C A A C-3′，下游引物5′-C T A A G C T C T C T T C A A A G A G G T T A T A G-3′；，上游引物5′-C C A A C A C A T T T G C A A G T T C A T T C C-3′，下游引物5′-A G A G G A A A C G A T G A A C T T A C A T T G G-3′。

從普通煙草(L.)cDNA模板中擴增全長cDNA，使用擴增整個cDNA序列的引物，然后將、和的擴增片段克隆到pMD-19 Simple T載體(TaKaRa)中進行測序分析。

1.2.2 生物信息學分析 用ClustalW進行多序列比對分析，用MEGA 7構建、和進化樹，設1 000次重復，使用默認參數(shù)。用ANTHERPROT進行氨基酸序列分析。用Interpro (http：//www.ebi.ac.uk/interpro/)掃描蛋白質序列以獲取結構信息，用TargetP 1.1服務器(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)分析預測包含N端前序的序列。用WoLF PSORT (https：//wolfpsort.hgc.jp/)確認3種酶可能的亞細胞定位。采用全自動蛋白質結構同源建模服務器 SWISS-MODEL(https：//www.swissmodel.expasy.org/)進行NtLOX、NtAOS和NtAOC的三級結構預測。

1.2.3 過表達載體的構建 PCR生成的包含開放閱讀框(ORF)的-片段、包含開放閱讀框的Ⅰ-Ⅰ片段和包含NtAOC開放閱讀框的Ⅰ-Ⅰ片段已被亞克隆到質粒 pCAMBIA1305.1-GUSPlus上。使用的引物如下：，上游引物5′-G G G G T A C C A T G T T T C T T G G A G A A G A T T G T G-3′，下游引物5′-G G G G T A C C C T A T A T G A C A C A C T G T T A G G-3′；，上游引物 5′-A A C T G C A G A T G G C A G T A G C A A C A G C A A C-3′，下游引物 5′-A A C T G C A G C T A A G C T C T C T T C A A A G A G G T-3′；，上游引物5′-G G G G T A C C A T G G C C A C T G C C T C C T C A G-3′，下游引物 5′-A A C T G C A G T C A A T T A G T G A A A T T T T T C A G G-3′。引物 M13-R 用于識別片段插入方向，基因融合表達由CaMV35S啟動子控制。

1.2.4 表達分析 在處理3、4、5、6周后(weeks after treatment，WAT)收獲幼苗。TRIzol? 試劑(Invitrogen公司，美國)用于從植物樣品中提取RNA。用基因特異性引物對目的基因、、和(登錄號：XM_016618658)進行qRT-PCR。在PCR中，使用 SYBR? Premix ExⅡ (TaKaRa Cat.RR820A)試劑盒配制反應溶液，使用StepOnePlus系統(tǒng)(應用生物系統(tǒng))進行PCR，共設3次技術重復。將表達水平標準化為，然后使用 方法計算倍數(shù)變化。將以下基因特異性引物對用于qRT-PCR：，5′-T G C C C T C A G T T C T T G A T G G A G T-3′和5′-C T T T G C T G C G T T T C C C T T G T-3′；，5′-G T T C G T C C C A T T A C A C T C T C-3′和5′-A G G A T C G G A A A A C T C T T G C C-3′；，5′-C T C C A C C A A C T C C A A G T C A T-3′和5′-C C C C T T T C T T T T C C T C T T C G-3′；和，5′-A A G G G A T G C G A G G A T G G A-3′和5′-C A A G G A A A T C A C C G C T T T G G-3′。

2 結果與分析

2.1 序列的克隆和生物信息學分析

在普通煙草中鑒定了JA合成途徑中3個關鍵的基因，分別為、和。長2 831 bp，有1個可編碼862個氨基酸的ORF，其相對分子量為97.6 ku。、的長度分別為1 569、983 bp(圖1)。、分別編碼522、245個氨基酸的ORF，相對分子量分別為58.9、26.5 ku。

NtLOX與來自普通煙草、番茄()、辣椒()和漸狹葉煙草()的脂肪氧化酶具有最大的相似度。煙草脂氧合酶與白黃麻()具有更高的同一性，NtLOX與CcLOX(登錄號：OMO62561)的氨基酸序列同一性為73%。

NtAOS與來自普通煙草、馬鈴薯()、辣椒和漸狹葉煙草的丙二烯氧化合酶具有最高的相似度。NtAOS與甜瓜具有較高的氨基酸序列同一性，NtAOS與CmAOS1(登錄號：NP_001315375)之間有68%的氨基酸序列同一性。

NtAOC與來自普通煙草、馬鈴薯、番茄、莨菪()和長春花()的脂肪氧化酶具有最大的相似性。煙草AOC與蒺藜苜蓿()的同一性更高，NtAOC與MtAOC(登錄號CAI29046)的氨基酸序列同一性為65%。

圖2-A顯示了NtLOX與其他植物物種特征蛋白之間的關系，其中NtLOX與NbLOX之間的關系最密切。圖2-B顯示了NtAOS與其他植物物種特征蛋白之間的關系，其中NtAOS與NaAOS之間的關系最密切。圖2-C顯示了NtAOC與其他植物物種的特征蛋白之間的關系，其中NtAOC與StAOC、SlAOC、HnAOC、LcAOC之間的關系最密切。

2.2 NtLOX、NtAOS和NtAOC的結構分析

Interpro序列分析和分類結果顯示，NtLOX屬于植物脂肪氧化酶家族(結構域編號：IPR001246)。NtLOX包含3個域：PLAT/LH2域(結構域編號：IPR001024，17～173位氨基酸)、結構域3(結構域編號：IPR027433，289～378位氨基酸)和C端(結構域編號：IPR013819，163～862位氨基酸)(圖3-A)。此外，在NtLOX的518～532位氨基酸處發(fā)現(xiàn)了1個鐵結合位點。GO途徑和分子功能預測結果表明，NtLOX參與氧化還原過程(GO：0055114、0016702)。NtAOS是細胞色素P450、E類、Ⅳ組(結構域編號：IPR002403)家族成員(圖3-B)。結構域分析結果表明，NtAOS的57～506位氨基酸將其歸類為SSF48264超家族的一部分。與NtLOX類似的是，NtAOS參與氧化還原過程(GO：0055114、0016705)。結構域分析結果顯示，NtAOC的73～245位氨基酸可能編碼屬于SSF141493超家族的域。分子功能分析結果表明，NtAOC具有異構酶活性(GO：0016853，圖3-C)。

蛋白激酶C、酪氨酸激酶和酪蛋白激酶Ⅱ誘導的磷酸化以及-肉豆蔻酰化位點在NtLOX、NtAOS和NtAOC中高度保守。除了所有3種蛋白質共有的位點外，筆者還在NtLOX中發(fā)現(xiàn)了另外2個位點，即-糖基化位點、依賴于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點。

使用TargetP 1.1服務器分析NtLOX的亞細胞定位，分別獲得了概率值為 0.134、0.093和0.040的葉綠體轉運肽(cTP)、線粒體靶向肽(mTP)和信號肽(SP)。NtAOS的TargetP 1.1分析得出的cTP、mTP、SP概率值分別為0.802、0.148、0.127，表明NtAOS最有可能位于葉綠體上。NtAOC的TargetP 1.1分析得出的cTP、mTP、SP概率值分別為0.954、0.044、0.005，表明NtAOC位于葉綠體中。WoLF PSORT被用于進一步預測蛋白質的亞細胞定位。結果顯示，NtAOS、NtAOC明確定位于葉綠體上，而NtLOX定位于細胞質上。不同LOX蛋白在不同細胞器中發(fā)揮著不同的作用，擬南芥基因組至少包含4個基因，其中位于細胞質中，位于質體基質中。與類似的是，、包含葉綠體轉運肽序列，但它們被視為質體。在葉片衰老的過程中，的表達量明顯升高，而的表達量急劇下降。

NtLOX的SWISS-MODEL預測結果表明，該蛋白質與大豆脂氧合酶(LOX-3) 1rrl.1相似，在氨基酸模型-模板范圍內具有65.33%的序列同一性(25～862位氨基酸，圖4-A)。NtAOS的全自動蛋白質結構同源性建模結果表明，該蛋白質與擬南芥AOS 3dsi.1具有結構相似性，在氨基酸模型-模板范圍內(57～522位氨基酸)中具有68.63%的序列同一性(圖4-B)。NtAOC的蛋白質結構同源性建模結果表明，它在結構上與擬南芥AOC2 4cq6.1相似，在氨基酸模型-模板范圍內(73～245位氨基酸)具有67.43%的序列同一性(圖4-C)。

2.3 過表達載體的構建

將限制酶消化位點引入開放閱讀框中，Ⅰ-Ⅰ、Ⅰ-Ⅰ和Ⅰ-Ⅰ位點分別被引入、和。每個基因序列通過PCR擴增(圖5-A)，每個片段用相應的限制酶消化(圖5-B)。將限制性片段亞克隆到質粒pCAMBIA1305.1-GUSPlus中。用擴增基因序列的引物鑒定成功轉化的含有所需質粒的菌落(圖5-C)。其中引物M13-R用于確定、的插入方向。存在擴增片段表明插入片段處于正向(對應圖5-D，對應圖5-E)。

2.4 NtLOX、NtAOS和NtAOC的表達分析

在鉀充足的條件下，煙草ND202的基因型比NC89的基因型積累了更多的鉀。然而，ND202比NC89對低鉀脅迫更敏感。有趣的是，在ND202、NC89植物中，、在鉀充足條件下的表達水平高于低鉀條件(ND202對應圖6-A、圖6-C；NC89對應圖6-B、圖6-D)。在鉀充足條件下，NC89的相對表達水平在4、5、6 WAT時分別是0.76、2.55、1.83倍(圖6-B、圖6-D)。在缺鉀條件下，ND202的、表達水平在4、5、6 WAT沒有明顯變化(圖6-C)。然而，在相同條件下，在5 WAT轉錄水平下表達水平明顯增加(圖6-C)，NC89在4 WAT的相對表達水平明顯改變并持續(xù)到6 WAT。值得注意的是，NC89的相對表達水平在4、5、6 WAT時分別是3.24、2.38、5.41倍(圖6-D)。上述結果表明，無論植物的基因型如何，在鉀充足的條件下，、的表達量都會增加(圖6-A、圖6-B)。在缺鉀條件下，與ND202敏感基因型相比，NC89耐受基因型的表達更為及時，并持續(xù)更長時間。因此可見，的表達水平可能與植物對低鉀脅迫的抗性相關。

有文獻報道了擬南芥鋁脅迫3 h時，與根中JA合成相關的基因上調表達，如、和。當鋁脅迫持續(xù)6 h時，、和的表達水平下降。然而，鋁脅迫對與JA生物合成相關的其他基因的表達沒有影響，如、和。據(jù)報道，缺鉀植物中JAs、羥基-12-氧代-十八碳二烯酸和12-氧代-植物二烯酸的水平高于鉀充足的植物。在低鉀脅迫下，13-LOX途徑中的營養(yǎng)儲存蛋白(vegetative storage protein，)、和其他酶的轉錄水平增加。與對照相比，在N、P或Ca缺乏條件下生長2周的植物中，或的轉錄水平沒有增加。然而，在缺鉀植物中，、轉錄本大大增加，分別編碼9-LOX和另一種 13-LOX，同種型的、沒有太大變化。本研究結果也表明，并非所有JA合成相關基因都對低鉀脅迫能作出反應(圖 6-C、圖6-D)。

3 結論與討論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，JA在非生物脅迫中具有重要作用。淹水會導致植物缺氧，淹水后暴露于氧氣(即再充氧)中稱為復氧。參與茉莉酸合成途徑的基因(包括、和)的轉錄水平在復氧過程中上調。外源性MeJA的應用提高了擬南芥對復氧脅迫的耐受性，而缺乏JA 合成(如和)和信號通路(如和)的突變體對復氧的敏感性增加。編碼JA信號傳導所必需的關鍵轉錄因子。與野生型相比，MYC2-OE顯示出較少的損傷，而、突變體在再充氧4 d后顯示出更多的損傷。這些發(fā)現(xiàn)表明，JA通過激活抗氧化防御系統(tǒng)，成為植物對淹沒后復氧反應必不可少的主要上游信號分子，這反過來又有助于減輕復氧引起的氧化損傷，進而提高植物對復氧脅迫的耐受性。

干旱是作物生產力的主要限制因素。近期的研究發(fā)現(xiàn)，JA途徑參與了玉米的干旱脅迫。關于玉米微陣列的研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，編碼LOX同種型的6種LOX酶中的4種酶的基因(即、、和)的表達水平提高，在伸長、成熟組織中、的表達水平最高?？侺OX活性和MDA含量緊隨響應干旱的轉錄譜，向葉的成熟部分增加，表明干旱在葉片的所有區(qū)域誘導氧化損傷，成熟組織表現(xiàn)出最強的反應。這些結果表明干旱脅迫會對葉片所有部分造成氧化損傷，在成熟組織中觀察到最強的反應。有研究者觀察到隨著葉片的成熟脂質過氧化，部分LOX活性增強。這些結果可以支持茉莉酸的產生是因為茉莉酸生物合成涉及通過脂質氧化合成脂氧合物(oxylipins)，特別是，其轉錄水平在脅迫條件下被顯著誘導，這是造成根中脅迫誘導茉莉酸積累的原因。

憑借與生長素、乙烯的相互作用，茉莉酸對調節(jié)環(huán)境脅迫下的根系生長發(fā)育極為有益。例如，由于鹽分脅迫，水稻生長普遍受到限制。突變體對鹽脅迫表現(xiàn)出較弱的敏感性。和突變體可以在其葉片中積累少量Na，并且可以更好地清除鹽脅迫所產生的活性氧。在應激傳導中，野生型葉片及JA突變體可以積累相似數(shù)量的脫落酸。在寬型葉片中，JA及其氨基酸結合物(JA-異亮氨酸)的水平變化不大。相比之下，野生型強烈誘導JA前體12-OPDA對鹽脅迫作出反應，這在突變體中沒有出現(xiàn)。突變體中12-OPDA的缺失不僅與普遍增加的活性氧清除活性相關，而且與抗氧化途徑中特定酶的更高活性相關。外源JA加強了對鋁誘導的根生長的抑制。此外，根據(jù)JA生物合成或信號傳導缺陷突變體的表型分析結果，JA參與調節(jié)了鋁誘導的根生長抑制?？傊?，JA對于植物生長的調節(jié)是復雜的。

JA對非生物脅迫具有重要意義。本試驗基于qRT-PCR分析了在缺鉀條件下2種基因型品種JA合成途徑3個基因的表達模式，耐低鉀基因型表達水平升高更早且持續(xù)時間更長，表明的表達水平可能與低鉀脅迫的耐性相關。