李寶昌， 陳 岳，2， 張 涵， 張微微

(1.上海農(nóng)林職業(yè)技術學院，上海 201699； 2.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240)

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物生長和逆境響應中發(fā)揮著至關重要的功能。其中NAC類家族蛋白是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子之一，其名字來源于矮牽牛的NAM (no apical meristem)、擬南芥的ATAF1/2 (transcription activation factor)和CUC2 (cup-shaped cotyledon)的首字母縮寫而成。NAC轉(zhuǎn)錄因子具有獨特的結(jié)構(gòu)特征，N端含保守的蛋白結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由A、B、C、D、E等5個亞結(jié)構(gòu)域組成。NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育和脅迫響應中均發(fā)揮重要作用。例如擬南芥受到HO、NaCl和聚乙二醇的誘導表達，并通過響應這些脅迫促進葉片的衰老。此外，擬南芥的、和均受到鹽、干旱、脫落酸和茉莉酸的誘導表達。

黃瓜(L.)是葫蘆科一年生草本植物，是我國主要蔬菜作物之一。由于黃瓜根系脆弱、好氣、分布淺，因此對鹽脅迫十分敏感。發(fā)生鹽害時，會對黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴重影響。因此，黃瓜耐鹽是近年研究熱點之一。劉東讓等對黃瓜耐鹽種質(zhì)資源進行了篩選，同時提出了當前黃瓜耐鹽脅迫育種中存在的問題。Zhu等在煙草中過表達黃瓜的基因，發(fā)現(xiàn)可以影響煙草中多胺和乙烯的合成，進而提高煙草耐鹽性。Liu等利用耐鹽親本CG104和對鹽敏感的親本CG37構(gòu)建了重組自交系群體，通過圖位克隆獲得了1個耐鹽相關的主效QTL，并提出了2個候選基因。盡管NAC基因在植物中的耐鹽研究報道了很多，在黃瓜中卻鮮有報道。本研究通過同源克隆獲得了黃瓜基因，并對其進行了生物信息學分析，利用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)分析了該基因在不同器官中的表達，在此基礎上進行鹽脅迫，分析處理后該基因的表達，為今后深入研究其功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 基因的克隆與鑒定

在TAIR網(wǎng)站下載擬南芥NAC032(AT1G77450)的蛋白序列，將該序列比對到黃瓜9930 V2版基因組(http：//cucurbitgenomics.org/ftp/genome/cucumber/Chinese_long/v2/)，獲得NAC032在黃瓜中的同源基因，將其命名為。在編碼區(qū)設計特異引物CsNAC032_F(5′-A T G A C C T T A G C T G G G C T C G T G-3′)和CsNAC032_R(5′-T T A A A T C T G C C T C T G T A G A T A A G A A A A C-3′)。以黃瓜葉片的cDNA為模板，CsNAC032_F和CsNAC032_R為引物，選用TaKaRa公司的PrimeSTAR Max Premix進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。將目標片段連接至pClone007 Blunt Vector克隆載體，熱激法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，用通用引物進行菌落PCR篩選，將陽性克隆送往上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2 CsNAC032的生物信息學分析

利用Expasy網(wǎng)站的“Compute pI/Mw tool”對的等電點與分子量進行預測。利用ProtComp 9.0網(wǎng)站對的亞細胞定位進行預測。利用PlantCARE網(wǎng)站的“Search for CARE”對的轉(zhuǎn)錄起始點上游2 000 bp的序列進行啟動子元件預測。從NCBI (http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站中下載植物NAC-like序列(表1)。利用DNAMAN軟件對10種植物的序列進行多序列比對，并通過MEGA X軟件構(gòu)建Neighbor Joining系統(tǒng)進化樹(bootstrap值為1 000)。

表1 不同植物的NAC-like蛋白信息

1.3 黃瓜CsNAC032的表達分析

2021年9月在上海農(nóng)林職業(yè)技術學院五厙實訓基地種植黃瓜自交系9930。當黃瓜幼苗生長到5張真葉時，取根、莖、葉、子葉；當黃瓜生長到20節(jié)位時，取雄蕊，雌蕊，花瓣，果刺，果皮，卷須。當黃瓜處于5張真葉時，將100 mmol/L的NaCl添加到營養(yǎng)液中，并在處理后的1、3、6、12、24 h分別取葉片，每次取樣3個重復。樣本采取后立即置于液氮中，放于-80 ℃冰箱中備用。

通過全能型植物RNA提取試劑盒(DNase Ⅰ)分別提取各個器官的總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiFiScript cDNA Synthesis Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基因編碼區(qū)序列，設計特異性引物RT-CsNAC032F(5′-T T C A G A T T T C A C C C T A C T G A T G A G-3′)和RT-CsNAC032R(5′-G A G A T C A A T C T C C T T G A T G A T G G-3′)，用HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑進行qRT-PCR試驗，檢測在黃瓜不同器官以及鹽處理后的表達情況。黃瓜()基因為對照。定量PCR相關試劑均購買于江蘇康為世紀生物科技股份有限公司。使用CFX96 TouchReal-Time PCR System進行反應，采用2-ΔΔ方法進行基因的相對表達量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取與基因克隆

通過Blast比對，獲得擬南芥基因在黃瓜中的同源基因，將其命名為。利用黃瓜葉片cDNA對進行擴增，電泳檢測后發(fā)現(xiàn)在1 000 bp位置有單一條帶(圖1)。將該片段回收后連接克隆載體進行轉(zhuǎn)化，測序結(jié)果顯示基因CDS長900 bp，編碼299個氨基酸，其相對分子質(zhì)量是34 271.63，等電點是5.67。亞細胞定位預測定位于細胞核，符合其轉(zhuǎn)錄因子的特性。

2.2 CsNAC032的進化分析

利用DNAMAN軟件對黃瓜的CsNAC032和其他植物的9條NAC-like蛋白序列進行相似性比對(圖2)。結(jié)果表明，黃瓜CsNAC032與甜瓜的CmNAC-like和冬瓜的BhNAC-like同源性最高，分別是97.00%和95.00%，與印度南瓜、中國南瓜、西葫蘆、苦瓜、野生灰籽南瓜、擬南芥、水稻的 NAC-like 蛋白同源性依次降低，分別為86.09%、85.76%、85.43%、82.24%、73.79%、56.92%、52.44%。此外，這些序列均擁有NAC家族蛋白典型的保守結(jié)構(gòu)域，在N端約150個氨基酸中共包含A、B、C、D、E等5個保守的亞結(jié)構(gòu)域。

為了分析黃瓜的CsNAC032在進化中的位置，利用多序列比對的10條蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹，結(jié)果(圖3)顯示，10條蛋白序列分為2組， 水稻的ONAC048和擬南芥的NAC032聚為一組，葫蘆科植物的NAC-like蛋白序列聚為另一組。其中，黃瓜CsNAC032與甜瓜的CmNAC-like和冬瓜的BhNAC-like蛋白又聚為同一亞組，說明它們的親緣關系較近，與多序列比對的結(jié)果一致。

2.3 啟動子元件分析

利用Plantcare對起始密碼子上游 2 000 bp 的啟動子區(qū)域進行分析(表2)，結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)錄起始點上游除了含有真核生物啟動子固有的TATA區(qū)和CAAT區(qū)外，啟動子區(qū)域還包含1個防御脅迫響應元件(defense and stress responsive)、1個赤霉素響應元件(gibberellin responsive)、2個水楊酸響應元件(salicylic acid responsive)、4個茉莉酸甲酯響應元件(meja responsive)、7個脫落酸響應元件(abscisic acid responsive)和10個光周期響應元件(light responsive)。

表2 CsNAC032啟動子區(qū)的順式作用元件分布及功能

2.4 CsNAC032基因在不同器官中的表達模式

利用qRT-PCR檢測基因在黃瓜不同器官中的表達情況，結(jié)果(圖4)顯示，在黃瓜子葉中相對表達水平最高，其次是根、果刺、莖、果皮、卷須中，在葉片、雄蕊、花瓣和雄蕊中表達水平較低。

2.5 CsNAC032基因在鹽脅迫處理下的表達模式

用100 mmol/L的NaCl處理黃瓜幼苗，分別于處理后1、3、6、12、24 h通過qRT-PCR檢測基因的表達水平，結(jié)果(圖5)顯示：在鹽脅迫的3 h后，表達水平升高，并于處理后12 h表達水平達到最高，達到初始水平的10倍左右，說明可以響應鹽脅迫的誘導。

3 討論

本研究利用擬南芥的基因，通過同源克隆獲得了其在黃瓜中的同源基因。編碼區(qū)為900 bp，編碼299個氨基酸，N端含有NAC家族蛋白典型的結(jié)構(gòu)域，包含A、B、C、D、E 5個亞結(jié)構(gòu)域。亞細胞定位預測CsNAC032主要在細胞核中發(fā)揮功能，進化樹分析表明該蛋白與甜瓜的CmNAC-like(NP_001284423.1)親緣關系最近。qRT-PCR檢測基因在黃瓜不同器官中的表達情況，發(fā)現(xiàn)其在主要在根、莖、子葉、果刺等營養(yǎng)器官中表達，在雄蕊、雌蕊等生殖器官中相對表達水平較低，說明可能還參與了黃瓜營養(yǎng)器官的發(fā)育。

NAC是植物中廣泛存在的一類轉(zhuǎn)錄因子，大量的NAC轉(zhuǎn)錄因子受生物和非生物脅迫誘導表達。在啟動子上發(fā)現(xiàn)了多個響應激素信號通路和逆境脅迫的元件，如防御脅迫響應元件、赤霉素響應元件、水楊酸響應元件、茉莉酸甲酯響應元件、脫落酸響應元件和光周期響應元件，這些元件在黃瓜NAC家族基因啟動子中相對保守，這與辣椒和玉米NAC基因的啟動子元件分析結(jié)果類似。NAC基因可能通過這些元件受相應的信號誘導表達。

番茄的NAC轉(zhuǎn)錄因子受到HO、NaCl、聚乙二醇(PEG)的誘導表達，基因TRV干擾掉后，番茄的抗干旱能力顯著下降。水稻的NAC家族膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子在NaCl和42 ℃的高溫處理后，表達量上調(diào)。利用CRISPR-Cas9技術編輯后，突變體對高溫脅迫敏感，耐熱能力減弱。在小麥中敲除會減弱植株的耐旱性，而該基因過表達后可以提高水分利用效率和增加脅迫響應基因的表達來顯著增強小麥耐旱性。水稻的、番茄的、葡萄的均受到NaCl、ABA、干旱以及高溫的誘導，進而調(diào)控下游基因以增強植物的抗逆能力。黃瓜受鹽脅迫后，在葉片的表達水平顯著上調(diào)，說明可能在黃瓜抵御鹽脅迫中發(fā)揮著一定功能。

本研究利用擬南芥的基因，通過同源克隆獲得了其在黃瓜中的同源基因。通過生物信息學方法對其序列以及表達進行了分析，推測可能響應鹽脅迫。本研究為進一步研究其功能奠定了初步基礎，但其脅迫響應機理有待進一步研究。