柳青

40 年來,金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌是較常見的呼吸道致病菌,其生物學(xué)特征是以生物膜為主的侵襲人體［1］。球菌和鏈球菌大量存活在醫(yī)院中,能導(dǎo)致嚴(yán)重的院內(nèi)感染。近些年,肺炎鏈球菌已經(jīng)是院內(nèi)感染下呼吸道炎癥最主要的致病菌之一。肺炎鏈球菌會導(dǎo)致長期間斷發(fā)作的肺炎,其致病性和病死率均較高。即便大量輸注抗生素,對其也不易形成有效抑制。研究人員發(fā)現(xiàn),細(xì)菌導(dǎo)致的肺炎是在生物膜中進(jìn)行的,是反復(fù)感染的原因所在［2］。因外院內(nèi)獲得性肺炎發(fā)病率高,其死亡率可有50%以上。所以,是否能發(fā)現(xiàn)一種耐藥性較弱的藥物,就是治療該病的關(guān)鍵。之前,由于抗生素的大量使用可以很好地控制細(xì)菌繁殖,但是又有大量的過敏癥狀、逐漸增加的耐藥性和肝腎功能損傷,限制了其持續(xù)使用。乳酸桿菌產(chǎn)細(xì)菌素是明顯抑制細(xì)菌繁殖的蛋白質(zhì)之一,而且細(xì)菌素對細(xì)菌載體無明顯損傷,具有優(yōu)良的生物穩(wěn)定性,可以在腸道內(nèi)直接吸收,不會產(chǎn)生蓄積作用,現(xiàn)在已經(jīng)被越來越多的臨床醫(yī)師所注意。細(xì)菌素作為一種抗菌化合物,具有強(qiáng)烈抗菌活性,如革蘭陽性和革蘭陰性細(xì)菌。此次試驗(yàn)通過比較乳酸桿菌產(chǎn)細(xì)菌素抑制兩種細(xì)菌的繁殖和干擾生物膜的功能,體現(xiàn)乳酸桿菌產(chǎn)細(xì)菌素對于治療臨床肺炎的重要意義?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019 年1 月～2020 年12 月北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中收治的40 例肺炎患者作為研究對象,痰液中分離培養(yǎng)出20 株金黃色葡萄球菌和20 株肺炎鏈球菌。

1.2試劑與儀器 選用保溫的培養(yǎng)箱、菌落分析儀(法國BioMerieux 公司),VITEK-32 全自動微生物分析儀(法國生物梅里埃公司),旋轉(zhuǎn)振蕩器(上海皓莊儀器有限公司),-80℃低溫培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司),高壓滅菌儀(寧波Runyes 公司),電子掃描顯微鏡(日本Nikon 公司),潔凈操作臺(美國Thermo 公司)。

1.3方法

1.3.1痰液標(biāo)本采集 囑患者早晨先用干凈水清潔口腔,再使勁咳嗽,將氣道深處的痰液咳出,留取第二次的痰液,放在無菌試管內(nèi)保存,立即送檢。把送來的痰液播撒在血瓊脂表面,在低濃度氧氣環(huán)境下(5%O2,10%CO2,85%N2)37 ℃培養(yǎng)24 h。再把細(xì)菌放置在VITEK-32 全自動微生物分析儀內(nèi)經(jīng)液化后放置在-80℃保存。試驗(yàn)時把兩種致病菌放置在血瓊脂上(37℃,6%CO2培養(yǎng)箱)培養(yǎng)24 h。

1.3.2乳酸桿菌產(chǎn)細(xì)菌素提取 把乳酸桿菌放置在血瓊脂上培養(yǎng)24 h(37℃,6%CO2培養(yǎng)箱),乳酸桿菌從發(fā)酵物中提取。用分析儀調(diào)配濃度為3×108CFU/ml 的乳酸桿菌懸濁液。5 ml 乳酸桿菌懸濁液和95 ml 液體培養(yǎng)基(大豆蛋白粉、牛肉粉、發(fā)酵粉提供氮元素和其他營養(yǎng)物質(zhì)；葡萄糖是可水解的糖類；磷酸氫二鉀作為酸堿中和劑；檸檬酸三銨、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80 和乙酸鈉為可以產(chǎn)生各種生長因子,并干擾其他雜菌的生長；瓊脂可固定懸濁液)攪拌后放置在37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)48 h,用離心機(jī)分離出混懸液的上清液,用0.22 μm 的生物膜把細(xì)菌過濾后提取其蛋白。再次放在離心機(jī)中壓縮至1 ml,然后放在EP 管中,用4℃的清液進(jìn)行封存。

1.3.3乳酸桿菌產(chǎn)細(xì)菌素對金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌分離株的生長抑制作用 把金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌都稀釋為1.5×108CFU/ml 的混懸液后,實(shí)驗(yàn)組分別添加0.05 ml 金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的混懸液、0.1 ml 細(xì)菌素混懸液和2 ml BHI 液體培養(yǎng)基(用動物內(nèi)臟浸入肉湯中生成的培養(yǎng)物通常簡稱BHI 培養(yǎng)基,主要保存各種難以生存的致病微生物,BHI 培養(yǎng)基是廣泛使用的培養(yǎng)基,細(xì)菌、霉菌和發(fā)酵菌都可以繁殖)。操作過程中必須保持實(shí)驗(yàn)的公平性和合理性,所有操作都用移液槍轉(zhuǎn)移混懸液。對照組的細(xì)菌素混懸液替換為生理鹽水,所有標(biāo)本都放置在37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

24 h 培養(yǎng)結(jié)束后取出試管充分震蕩,提取0.1 ml的混懸液,將其濃度逐漸稀釋至10-6倍,再取其中的0.05 ml 稀釋后的混懸液平均播撒在血瓊脂上,用37℃、6%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,最后計算菌落總數(shù)(CFU)。根據(jù)公式：抑菌率(%)=(對照組細(xì)菌菌落總數(shù)-實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌菌落總數(shù))/對照組細(xì)菌菌落總數(shù)×100%,推算出抑菌率。

1.3.4乳酸桿菌產(chǎn)細(xì)菌素對金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌分離株生物膜的作用 ①生成金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的生物膜：把金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌分別放置在血瓊脂培養(yǎng)皿中,在37℃、6%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,放置在酸堿中和液中,混合成1.5×108CFU/ml 的懸濁液,把蓋玻片放置在無菌平皿中,實(shí)驗(yàn)組中放入9 ml BHI 液體培養(yǎng)基和含有0.1 ml 金黃色葡萄球菌或肺炎鏈球菌的混懸液,0.1 ml 的細(xì)菌素混懸液；對照組中放入9 ml BHI 液體培養(yǎng)基和0.1 ml 酸堿中和液,0.1 ml 金黃色葡萄球菌或肺炎鏈球菌的混懸液,全部放置在37℃、6%CO2的培養(yǎng)箱中保存24 h。②計算體外生物膜細(xì)菌個數(shù)：生物膜生成24 h 后移走蓋玻片,進(jìn)行充分剝離出粘附在表面的細(xì)菌后用酸堿中和液逐漸稀釋到10-4倍,取出約0.05 ml 的混懸液平均播撒在血瓊脂上,在37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,計算菌落總數(shù)。根據(jù)公式：滅活率(%)=(對照組細(xì)菌菌落總數(shù)-實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌菌落總數(shù))/對照組細(xì)菌菌落總數(shù)×100%,推算出滅活率。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌菌落數(shù)比較實(shí)驗(yàn)組金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌菌落數(shù)分別為(3.41±0.91)×108CFU/ml、(4.81±1.21)×108CFU/ml,均低于對照組的(12.76±3.21)×108CFU/ml、(14.32±3.81)×108CFU/ml,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌菌落數(shù)比較(,×108 CFU/ml)

表1 兩組金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌菌落數(shù)比較(,×108 CFU/ml)

注：與對照組比較,aP＜0.05

2.2乳酸桿菌產(chǎn)細(xì)菌素對不同細(xì)菌的抑菌率、滅活率比較 乳酸桿菌產(chǎn)細(xì)菌素對金黃色葡萄球菌的抑菌率為89.64%、滅活率為73.28%,均高于對肺炎鏈球菌的75.11%、66.41%。見表2。

表2 乳酸桿菌產(chǎn)細(xì)菌素對不同細(xì)菌的抑菌率、滅活率比較(%)

3 討論

金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌是人類呼吸道的主要致病菌［3］。生物膜是許多微生物的基本結(jié)構(gòu),以此為特點(diǎn)的致病菌可導(dǎo)致許多感染疾?。?］。根據(jù)研究認(rèn)為抗菌藥物出現(xiàn)耐藥性是生物膜的特殊功能導(dǎo)致的,因此,發(fā)現(xiàn)可靠消除生物膜的方法就成為臨床探討的重點(diǎn)。試驗(yàn)證實(shí)［5］,細(xì)菌素能抑制生物膜的形成,降低細(xì)菌的耐藥性。此次試驗(yàn)中,乳酸桿菌中提取的細(xì)菌素對臨床分離致病菌有很強(qiáng)的抑制作用,與金瑛等［6］和楊玉芳等［7］的試驗(yàn)結(jié)果相同。細(xì)菌素是一種兼具抗革蘭陽性和陰性菌的化合物。所以細(xì)菌素可以對許多致病菌產(chǎn)生抗菌作用。金亮等［8］從生乳中分離,該菌株產(chǎn)生細(xì)菌,對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌有活性,產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對蛋白質(zhì)溶解敏感,具有耐熱性,對多種pH 有抗性。姜晶［9］在4℃和15℃的兩種不同儲存溫度下,在乳酪繁殖的情況下檢測透明乳桿菌2a的含量,并且在兩種溫度下抑制單個細(xì)胞基因的生長。張國強(qiáng)等［10］比較了在萊桑乳清中培養(yǎng)的30 株乳酸桿菌的抗真菌特性,發(fā)現(xiàn)了一種可以抗真菌的乳酸桿菌?？镎涞龋?1］從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中提取出22 株乳酸菌BL-1,可明顯抑制革蘭陰性菌的生長。胡付品等［12］從酸菜中提取出4 株乳酸菌SD-22,對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有較強(qiáng)抗菌功能。乳酸桿菌通常被認(rèn)為是安全的微生物,大部分細(xì)菌都是天然的,并且乳酸桿菌具有良好的熱穩(wěn)定性和對酸、鹽和酶的耐受性。乳酸桿菌具有高效率、廣泛和安全性的特點(diǎn),可有效影響致病菌的生長。所以,探究乳酸桿菌所分泌的細(xì)菌素對致病菌的生長抑制作用,就顯得尤為重要。

綜上所述,乳酸桿菌產(chǎn)細(xì)菌素對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌的生長及生物膜都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用,相比之下,對金黃色葡萄球菌的抑制作用更明顯,可以體現(xiàn)乳酸桿菌產(chǎn)細(xì)菌素在臨床上顯著減輕肺炎癥狀的重要價值。